巨噬细胞内细胞内生长的定量化是评价利什曼原虫寄生虫毒力的快速可靠方法

利什曼病是指由利什曼原虫属的原虫寄生种类引起的广泛的人类疾病。目前约有1200万人感染了全球范围内的利什曼原虫, 3.5亿多名患者面临风险。疾病病理学依赖于利什曼原虫物种和寄主因素, 症状不同于无害的自我愈合皮肤病变和致命的 visceralizing 形式。如果未经治疗, 内脏利什曼病是致命的, 只有在疟疾后才会成为感染了原生动物寄生虫的最致命的人类疾病¹。尽管疾病病理和症状存在广泛的差异, 但所有的利什曼原虫物种分别在昆虫和脊椎动物寄主的 promastigote 和 amastigote 阶段之间有 digenic 的生命周期交替。在脊椎动物体内,利什曼原虫目标宿主巨噬细胞侵入, 并诱导 parasitophorous 液泡 (PVs) 的形成, 酸性隔层具有高度剧毒 amastigote 形态复制的 phagolysosomes 特性。Amastigotes 持续在宿主组织中的慢性感染, 可以传递到未感染的白蛉, 完成传输周期。因此, 在人类疾病发展的背景下, amastigotes 是最重要的利什曼原虫生命周期表单²。调查 amastigotes 如何在巨噬细胞 PVs 中复制对于了解利什曼原虫毒力^3,4,5,6,7和新的有效疗法的发展。

我们在这里描述了我们的实验室经常使用的方法来研究在骨髓源巨噬细胞 (BMMs) 中的利什曼原虫感染和复制, 这涉及到定量评估细胞内的利什曼原虫的数量随着时间的推移。该过程包括从小鼠骨髓中获取单核细胞和分化为培养的巨噬细胞,体外感染与感染型 (metacyclic 前鞭毛体或 amastigotes)的利什曼原虫和量化的每隔24小时胞内寄生虫的数量在感染后 72-96 小时内。本试验已在实验室中使用, 以确定几种环境因素和寄生虫基因的影响, 包括鉴定铁在促进L. amazonensis毒力方面的关键作用, 进一步验证了都安小鼠病变发育研究^6,8,9,10,11,^12,13,14,15.由于所有致病性的利什曼原虫物种都在宿主巨噬细胞内建立了它们的复制利基, 这种检测方法可普遍用于所有利什曼原虫物种的毒力测定。

执行法钢公司感染可以分析单个细胞层面上的寄主寄生虫相互作用, 从而更广泛地了解利什曼原虫寄生虫如何与他们的首选宿主微环境、巨噬细胞的 PVs 相互作用。巨噬细胞感染化验已成功使用多个组^{16,17,18,19,20,21,22} , 探索宿主巨噬细胞和利什曼原虫特定基因的功能, 以及它们在细胞内感染的复杂相互作用中的潜在参与。法钢公司感染允许将寄生虫生长量量化为对影响细胞内生存的宿主因素的影响的读出, 如杀菌剂一氧化氮生产、产生活性氧种类和其他不利条件在溶酶体样 PVs²³中遇到。巨噬细胞感染的检测也被用来识别潜在的抗 leishmanial 药物治疗发展的线索^13,24。

法钢公司感染的体外性质比其他评估利什曼原虫毒力的方法具有多种优势。然而, 以前的几项研究表明, 随着时间的推移, 细胞内寄生虫存活的机制并没有量化感染率为^20,21,24。此外, 许多研究侧重于以下的体内感染随着时间的推移, 通过测量皮肤病变大小和其他生理症状只是间接相关的寄生虫复制^25,26,27.体内感染是一种严格的评估寄生虫毒力的方法, 但仅基于都安肿胀的病变大小测量往往是不够的, 因为它们反映了感染组织的炎症反应, 而不是寄生虫的绝对数量。因此, 都安病变的发展化验必须遵循量化的寄生虫负荷的感染组织, 这一程序需要冗长的限制稀释化验²⁸。此外,体内研究通常涉及在不同时间点牺牲多个动物以提取感兴趣的组织^{6,8,9,10,11,13}. 相比之下, 大量的 BMMs 可以从一只动物身上获得, 这些细胞可以在允许在不同时间点对感染进行评估的条件下进行镀膜。此外, 与体内研究相比, 执行体外法钢公司感染可以更好地控制实验条件。量化的巨噬细胞感染与寄生虫本身允许精确控制感染的多样性 (语言) 和文化条件。对这些因素的精细控制是识别离散细胞通路特征和了解它们对感染过程的影响的关键。

考虑到这些优势, 对于研究利什曼原虫毒力的少数群体迄今充分利用细胞内复制的定量评估, 这一点令人吃惊。在本文中, 我们讨论了可能妨碍更广泛地利用此检测的常见缺陷, 并提供了一步一步的协议, 以促进其适当的实施。考虑到它的精确性和通用性, 我们在这里描述的法钢公司感染检测方法不仅可以用来探索影响利什曼原虫毒力的寄主病原体相互作用, 而且还能研究在体内复制的其他微生物。巨噬细胞²⁹。重要的是, 这种检测也可以作为一种快速、经济的临床前筛选方法, 用于抗 leishmanial 药物的开发。