CARIP-Seq와 칩 Seq: Chromatin 관련 된 RNAs 및 배아 줄기 세포에 단백질 DNA 상호 작용을 식별 하는 방법
Summary
여기, 우리는 칩 Seq를 수행 하는 방법을 설명 및 CARIP-Seq, 다음-세대 시퀀싱, 라이브러리 준비 등 글로벌 epigenomic 및 chromatin 관련 RNA 생성 하 ES 세포에 지도.
Abstract
배아 줄기 (ES) 세포 자체 갱신 및 차별화 외부 신호 및 녹음 방송 요인, 후 레 귤 레이 터, 및 combinatorially 유전자에 영향을 주는 히스톤의 포스트 번역 수정 내장 네트워크에 의해 규율 됩니다. 근처 유전자의 표현 상태입니다. RNA도 chromatin 역학 및 유전자 발현을 조절 하는 다양 한 단백질 상호 작용을 보였다. Chromatin 관련 RNA immunoprecipitation (CARIP) 다음-세대 시퀀싱 (CARIP-Seq) 다음 RNAs chromatin 단백질, 뒤에 다음-세대 시퀀싱 (chromatin immunoprecipitation 동안과 관련 된 조사를 소설 방법입니다. ChIP-Seq) 히스톤, 녹음 방송 요인과 ES 세포에서 글로벌 규모에 epigenetic 한정자의 포스트 번역 상 수정 위치를 매핑하는 강력한 유전체학 기술입니다. 여기, 우리는 CARIP-Seq와 칩 Seq, 다음-세대 시퀀싱, 도서관 건축을 포함 하 여 ES 세포에서 글로벌 chromatin 관련 RNA 및 epigenomic 지도 생성 하기 위해 수행 하는 방법을 설명 합니다.
Introduction
배아 줄기 (ES) 세포 운명 결정 extracellular 신호 및 transcriptional-레 귤 레이 터, 히스톤 한정자 및 히스톤 꼬리의 사후 번역 수정 포함 하 여 호스트 간의 통신에 의해 통제 된다. 이러한 상호 작용 촉진 chromatin 접근성 및 두 가지 상태 중 하나로 chromatin의 포장: euchromatin 열리고 transcriptionally 활성 되 고 섬으로, 콤팩트 하 고 transcriptionally 일반적으로 비활성 이다. 녹음 방송 요인 DNA 시퀀스 특정 바인딩 선호도와 epigenetic 한정자 연결 대상 euchromatic 지구 유전자 발현 조절에 참여 하. 다음-세대 시퀀싱 방법, 칩 Seq1를 포함 하 여 ES 세포 자체 갱신 및 pluripotency2,3,4에 대 한 근본적인 게놈 넓은 transcriptional 네트워크 매핑 수단이 ,,56. 또한, RNA immunopreciation RNA-단백질 상호 작용의 다음-세대 시퀀싱 (RIP-Seq)7 평가 뒤 동안 DNA 의무적인 단백질 transcriptional 이벤트7, 를 규제 하는 RNAs 상호 작용 제안 8 , 9 , 10 , 11 , 12, 몇 가지 연구 RNAs chromatin12또는 RNA와 히스톤 수정 사이 글로벌 상호 연관의 게놈 넓은 지역화를 조사 했습니다. 오래 비 코딩 RNAs (lncRNAs)는 있으면 chromatin 관련 단백질13,,1415의 활동을 규제 하는 RNAs의 한 클래스. 예를 들어 Xist epigenetic repressors16,17의 채용을 통해 하나의 X 염색체의 비활성화를 여성 포유류 세포에서 조절 하는 lncRNA 이다. 그러나, chromatin와 관련 된 RNAs의 전체 스펙트럼 크게 불명 하다. 여기, 우리는 새로운 프로토콜, chromatin 관련 RNA immunoprecipitation (CARIP)에 대 한 다음-세대 시퀀싱 (CARIP-Seq), 라이브러리 준비를 포함 하 여 ES 세포의 게놈 넓은 기준 chromatin 관련 RNAs를 식별 하기 위해 다음 설명 차세대 시퀀싱, 그리고 칩 Seq 매핑할 히스톤 수정, 녹음 방송 요인과 epigenetic 한정자의 글로벌 인. 달리 다른 RIP Seq 방법7, CARIP-Seq chromatin와 관련 된 RNAs의 직접 식별을 위해 허용 가교 및 쥡니다 단계를 포함 합니다. 함께, 칩 Seq 게놈 넓은 단백질 DNA 상호 작용을 식별 하는 강력한 도구, RNAs chromatin 구성 요소와 관련 된 CARIP-Seq는 조사 하는 강력한 방법.
Protocol
Representative Results
Discussion
칩 Seq 글로벌 단백질 DNA 상호 작용의 위치를 평가 하는 유용한 방법입니다 (예., 녹음 방송 요인/히스톤 수정 효소/히스톤 수정 DNA) ES 세포, 새로 개발된 된 CARIP-Seq 프로토콜에 유용 하는 동안에 질의 게놈 넓은 협회 RNAs의 chromatin 성분. 칩 Seq는 ES 세포의 epigenetic 풍경과 다른 세포 유형 평가 하는 데 사용 되는 기본 도구입니다. 칩 Seq 및 CARIP-Seq 라이브러리의 품질이 크게 칩 급 항 체에 의존 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품 웨인 주립 대학, Karmanos 암 연구소, 국가 심 혼, 폐 및 혈액 학회 (1K22HL126842-01A1) B.L.K.에 게 수 여에서 교부 금에 의해 지원 되었다 웨인 주립 대학 높은 성능 컴퓨팅 그리드 계산 리소스를 활용 하는이 작품 (). CARIP-Seq 데이터 분석 지원에 감사 연합 Kurup 하 고.
저자의 기여:
B.L.K.는 CARIP-Seq 방법의 임신, 시퀀싱 데이터 분석 그리고 원고 초안, 설계 및 칩 Seq와 CARIP-Seq 실험을 실시. 모든 저자는 읽고 있고이 원고의 최종 버전을 승인.
Materials
| Mouse leukemia inhibitory factor (ESGRO LIF) | EMD Millipore | 106 or 107 units | |
| GSK3β inhibitor CHIR99021 (GSK3i) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| MEK inhibitor PD0325901 (MEKi) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Invitrogen | 11965092 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Invitrogen | 10010031 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140076 | |
| EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml | EMD Millipore | ES-009-B | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | EMD Millipore | ES-006-B | |
| Glycine | Sigma | G7126-500G | 1.25 M stock conentration in water |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-500ML | |
| TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X | Quality Biological | 351-011-131 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) solution | Sigma | 93482-250ML-F | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution (20%) | Quality Biological | A611-0837-10 | |
| Q125 sonifier | Qsonica | 4422 | |
| Triton X-100 solution | Sigma | 93443-100ML | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10004D | |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein A/Protein G and Magnet Starter Pack | Invitrogen | 10015D | |
| Lithium chloride | Sigma | L4408 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Purification Kit (for mRNA purification from total RNA preps) | Invitrogen | 61006 | |
| SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11917010 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER81050 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | NEB | M0212L | |
| dATP (10 mM) | Invitrogen | 18252015 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen | 10488085 | |
| E-gel EX agarose gels, 2% | Invitrogen | G402002 | |
| Phusion high-fidelity 2X master mix with HF buffer | Thermo Fisher | F531LPM | |
| ChIPAb+ Trimethyl-Histone H3 (Lys4) – ChIP Validated Antibody | EMD Millipore | 17-614 | |
| Anti-Histone H3 (di methyl K4) antibody [Y47] – ChIP Grade (ab32356) | Abcam | ab32356 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-well) | Fisher | 720083 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (10cm) | Fisher | 08772E | |
| Bioruptor pico | Diagenode | B01010001 | |
| Qubit Flurometer 2.0 | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | |
| Anti-Histone H4 (tri methyl K20) antibody – ChIP Grade (ab9053) | Abcam | ab9053 | |
| Labquake rotator | Thermo Fisher | 400110Q | |
| Illumina HiSeq platform | Illumina | ||
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2238 |
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