MicroARN rétrospective séquençage : L’ADN complémentaire bibliothèque protocole de préparation à l’aide de spécimens d’ARN de paraffine fixés au formol

miARN est remarquablement bien conservés dans fixés au formol paraffine (FFIP) échantillons^1,2,3. Travaux antérieur ont démontré que l’expression de ces courtes réglementaire non codantes unique échoués des molécules d’ARN peut être évalué avec succès à l’aide de l’ARN total des échantillons FFPE et fournir des données pertinentes d’expression par rapport à l’original frais tissus^4,5,6,7,8. Par rapport aux ARN messagers de grande taille, qui se sont révélés d’être gravement affectés par FFIP traitement tissulaire (formaldéhyde, chaleur, dessiccation, etc.), des ribonucléases endogènes et l’âge des spécimens, la petite taille des miARN (~ 18 – 24 nucléotides) s’affiche pour les rendre résistants à la dégradation et résilient pour l’entreposage à long terme, a également démontré par des études d’expression de miRNA qui surpassent les études ADN messagère haut débit dans les spécimens archivés⁹. les études d’expression de miRNA archivés sur des échantillons cliniques, qui ont principalement été réalisées dans les analyses à petite échelle, ont démontré que seul ou multiplexé des analyses par PCR quantitatives, différents types de microarray technologies et plus récemment NGS peut servir à évaluer l’expression des miARN préservée après l’optimisation de ces dosages^{10,11,12,13,14}.

Étant donné que le dérèglement de miRNA expression a été associé au développement d’une variété de cancers humains et qu’il y a potentiellement une offre énorme de cliniquement annoté spécimens archivés, il est devenu évident que ces petits ARN molécules représentent une source prometteuse de potentiels du cancer biomarqueurs^15,16,17,18. L’utilisation d’une technologie d’expression de gène de haut-débit comme NGS a l’avantage de fournir une évaluation globale de toutes les transcriptions de miRNA par rapport aux technologies ciblées comme la PCR et/ou microarrays¹⁹. Pour cette raison, un protocole optimisé, abordable et facilement applicable pour la préparation de bibliothèque de cDNA de petits ARN de plus vieux spécimens archivés pour NGS a été optimisé pour permettre des études rétrospectives à grande échelle de²⁰.

Nous avons déjà établi un protocole d’extraction d’ARN/ADN simultané pour restauration séparée de l’ARN et l’ADN de plus vieux spécimens archivés, que nous avons trouvées pour surpasser les kits commerciaux contemporains²¹. À l’aide de ce protocole d’extraction, d’obtenir l’ARN total de tissus FFPE archivées pendant une période prolongée de temps, nous avons optimisé la préparation de banques d’ADNc pour NGS des miARN préservés dans les échantillons cliniques jusqu’à 35 ans. En outre, dans une étude récemment publiée, où nous avons préparé des banques d’ADNc de cliniquement classés carcinome canalaire in situ des spécimens (CCIS), nous avons identifié des miARN différentiellement exprimés qui ont été validées par PCR quantitative, qui indiquait que modifications de l’expression miRNA spécifiques peuvent être détectables dans les lésions de la CCIS de patients qui développent un cancer du sein par rapport aux lésions de la CCIS de patients qui ne développent pas de cancer du sein.

Si l’on considère le coût des trousses commerciales pour la préparation de petites banques d’ADNc de RNA, le potentiel de leur arrêt, ainsi que l’utilisation de réactifs/brevet protégé qui ne peut pas être optimisée, nous avons décidé d’adapter un publiées antérieurement en laboratoire et sans kit de 3′ Protocole bibliothèque préparation d’ADNc avec code à barres pour NGS de petits ARN archivées dans des échantillons FFPE, permettant l’analyse simultanée de 18 échantillons²². Ce protocole prévoit une procédure étape par étape idéale et robuste avec points de contrôle visuel et l’évaluation technique, qui critiquaient pour adaptation aux spécimens d’ARN FFIP, et a un fort potentiel d’application à d’autres sources de compromis ou difficile d’utiliser le matériel de RNA. Applicabilité du protocole original a été améliorée en remplaçant les marqueurs de taille marquée radioactivement avec fluorescentes (p. ex., SYBR Gold) détectables marqueurs de taille de RNA utilisés lors de la sélection des bibliothèques ligaturés sur grands gels de polyacrylamide. Ce protocole optimisé repose sur la ligature de barcoded adaptateurs de 3′ à 18 échantillons FFPE RNA individuels, qui sont alors regroupées ensemble pour subir une ligature des adaptateur 5′, transcription inverse, ainsi qu’une analyse PCR pilote pour adapté l’amplification de l’ADNc final Bibliothèque avant amplification PCR à grande échelle, purification et NGS sur un séquenceur haut débit.