Препараты и протоколы для всей ячейки патч зажим записи Xenopus laevis тектальный нейронов
Summary
В этой статье мы обсуждаем три мозга препаратов, используемых для записи зажим клеточных патч для изучения retinotectal цепь Xenopus laevis головастиков. Каждый подготовки, с свои собственные конкретные преимущества, способствует экспериментальной уступчивость Xenopus головастика как модель для изучения функции нейронные цепи.
Abstract
Xenopus головастика retinotectal цепи, состоит из клеток сетчатки ганглия (РГК) в глаза, какая форма синапсов непосредственно на нейронов в оптические tectum, является популярной моделью для изучения как нейронных цепей самостоятельно собрать. Способность выполнять целом ячейки записи зажим патч от тектальный нейронов и запись RGC-вызвала ответов, либо в естественных условиях или с помощью весь мозг подготовки, вызвала большой объем данных с высоким разрешением о механизмах, лежащих в основе нормальной и аномальные, схемы формирования и функции. Здесь мы опишем, как для выполнения в естественных условиях подготовка, оригинальные весь мозг, и более недавно разработала горизонтальный мозга ломтик подготовка для получения клеточных патч зажим записи от тектальный нейронов. Каждый препарат имеет уникальные экспериментальные преимущества. В естественных условиях подготовки позволяет запись прямого ответа тектальный нейронов визуальные раздражители, проецируется на глаз. Весь мозг подготовки позволяет RGC аксоны активироваться очень контролируемым образом, и подготовка срез горизонтальных мозга запись с на всех слоях tectum.
Introduction
Retinotectal схема является основным компонентом амфибия зрительной системы. Она состоит из РГК в глаза, которые проект их аксоны оптические tectum, где они образуют синаптических связей с тектальный постсинаптических нейронов. Схема retinotectal головастика Xenopus является популярной модели развития для изучения нейронные цепи формирования и функции. Существует множество атрибутов этот головастик retinotectal цепи, которые делают его мощным Экспериментальная модель1,2,3. Один из основных атрибутов и в центре внимания этой статьи, является способность выполнять клеточных патч зажим записи из тектальный нейронов, в естественных условиях или с помощью весь мозг подготовки. С буровой электрофизиологии, оснащен усилитель, который поддерживает записи режимов напряжения и тока зажим клеточных патч зажим записи позволяют электрофизиологии нейрон характеризуется высоким разрешением. В результате клеточных патч зажим записи от тектальный нейронов через основные этапы формирования retinotectal цепи представили подробное и всеобъемлющее понимание развития и пластичности встроенные4,5 , 6 , 7 и синаптическую8,9,10,11 свойства. Сочетание клеточных патч зажим тектальный нейрон записи, способствует способность выражать гены или морфолиновая интерес в этих нейронов12и метод для оценки управляемое поведение через установленных визуальных недопущение испытаний13 выявление связей между молекулами, цепи функции и поведение.
Важно отметить, что тип высокого разрешения, полученных из клеточных патч зажим записей данных возможен не с помощью новых изображений подходов, таких как генетические кальция индикатор GCaMP6, потому что хотя использование показателей кальция позволяет изображений кальция динамики через больших популяций нейронов одновременно, там нет прямого или очевидным способом что конкретных электрических параметров могут быть получены путем измерения флуоресценции Дельта в somata и нет никакого способа, чтобы напряжение зажим нейрон для измерения вольт амперных отношения. Очевидно эти два различных подхода, электрофизиологические записи и кальция изображений, обладают non перекроя сильные и генерировать различные типы данных. Таким образом наилучший подход зависит от конкретных экспериментальных вопрос решается.
Здесь мы описываем наш метод для получения клеточных патч зажим записи из нейронов оптические tectum головастика, с использованием в естественных условиях подготовка, весь мозг, и новые изменения весь мозг подготовки, которая была разработана в нашей лаборатории14 . В разделе представитель результаты мы демонстрируем экспериментальной преимущества каждого подготовки и различные виды данных, которые могут быть получены. Ограничения и сильные стороны различных препаратов, а также советы по устранению неполадок, включены в раздел “обсуждение”.
Protocol
Representative Results
Discussion
Все методы, описанные в этой работе оптимизированы для записи тектальный нейроны от головастиков между стадии развития 42 и 49, (постановка согласно Neiuwkoop и Фабер-15). На этапе 42, головастиков, достаточно большой и достаточно развитой так, что насекомое булавки могут быть разме?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
При поддержке гранта NIH SBC COBRE 1P20GM121310-01.
Materials
| Stemi Stereo 508 | Zeiss | 495009-0006-000 | Dissecting microscope |
| MS-222 "Tricane" | Finquel | ARF5G | Amphibian general anesthetic |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-1KG | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)•4H2O) | Sigma-Aldrich | 237124-500G | Used to prepare Stienberg's solution |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare Steinberg's solution |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | Used to prepare external recording solution |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | J.T. Baker | 2444-01 | Used to prepare external recording solution |
| D-glucose Anhydrous | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare external recording solution |
| Tubocurarine hydrochloride pentahydrate | Sigma | T2379 | Nicotinic acetylcholine receptor antagonist |
| Insect Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1mm diameter stainless steel pins |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761028 | Preweighed monomer and curing agent kit |
| Sterile Polystyrene Petri Dish – 60x15mm | Fisher Scientific | AS4052 | Small petri dishes |
| PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm) | BD | 305122 | Syringe needles |
| 1mL Slip Tip Tuberculin Syringe | BD | 309659 | Disposable, sterile syringes |
| Borosilicate pipette glass | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | Pulled to desired specifications using pipette pulling machine |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | Fabricates micropipettes for electrophysiology recording |
| Kimwipes Kimtech wipes | Kimberly-Clark | 34120 | Delicate task lint-free wipers |
| Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | Current clamp and voltage clamp headstage |
| MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop Controller | Sutter Instrument | MP-285/T | Control for headstage on electrophysiology rig |
| Fiber-Coupled LED (Green) | Thorlabs | M530F2 | Fiber optic cable paired with green LED |
| Cluster Bipolar Electrode (25µm diameter) | FHC | 30207 | Bipolar stimulating electrode |
| ISO-Flex Stimulator | A.M.P.I. (Israel) | Contact manufacturer | Flexible stimulus isolator |
| Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier | Molecular Devices | 2500-0157 | Amplifier for voltage- and current-clamp recording |
| Digidata 1322A digitizer | Molecular Devices | 2500-135 | Data acquisition system for electrophysiology recording |
| Axio Examiner.A1 | Zeiss | 491404-0001-000 | Microscope for electrophysiology |
| Micro-g Lab Table | TMC | 63-533 | Air table for electrophysiology microscope |
| Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bit | Dell | D06D001 | Computer running electrophysiology software |
| c2400 CCD camera | Hamamatsu | 70826-5 | Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging |
| 7 O'Clock Super Platinum Stainless Razorblades | Gillette | CMM01049 | Platinum-coated stainless razor blades |
| Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-711-7M | Disposable Polyethylene transfer pipets |
References
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
- Pratt, K. G. Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole. Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).
- Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit. Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).
- Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Region-specific regulation of voltage-gated intrinsic currents in the developing optic tectum of the Xenopus tadpole. J. Neurophysiol. 112 (7), 1644-1655 (2014).
- Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit. J. Neurosci. 27 (31), 8268-8277 (2007).
- Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity. Elife. 4, 11351 (2015).
- Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo. Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).
- Wu, G., Malinow, R. Cline H.T. of a central glutamatergic synapse. Science. , 972-976 (1996).
- Van Rheed, J. J., Richards, B. A., Akerman, C. J. Sensory-evoked spiking behavior emerges via an experience-dependent plasticity mechanism. Neuron. 87 (5), 1050-1060 (2015).
- Schwartz, N., Schohl, A., Ruthazer, E. S. Activity-dependent transcription of BDNF enhances visual acuity during development. Neuron. 70 (3), 455-467 (2011).
- Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J. Vis. Exp. (17), e705 (2008).
- Dong, W., et al. Visual avoidance in Xenopus tadpoles is correlated with the maturation of visual responses in the optic tectum. J. Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
- Hamodi, A. S., Pratt, K. G. The horizontal brain slice preparation: a novel approach for visualizing and recording from all layers of the tadpole tectum. J. Neurophysiol. 113 (1), 400-407 (2015).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J. Vis. Exp. (112), e54024 (2016).
- Muldal, A. M., Lillicrap, T. P., Richards, B. A., Akerman, C. J. Clonal Relationships Impact Neuronal Tuning within a Phylogenetically Ancient Vertebrate Brain Structure. Curr. Biol. 24 (16), 1929-1933 (2014).
- Khakhalin, A. S., Koren, D., Gu, J., Xu, H., Aizenman, C. D. Excitation and inhibition in recurrent networks mediate collision avoidance in Xenopus tadpoles. Eur. J. Neurosci. 40 (6), 2948-2962 (2014).
- Ruthazer, E. S., Aizenmann, C. D. Learning to see: patterned visual activity and the development of visual function. Trends Neurosci. 44 (4), 183-192 (2010).
- Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles. J. Neurophysiol. 102 (1), 399-412 (2009).
