インフラマソーム活性化とマウス骨髄由来マクロファージにおける Pyroptotic の細胞死の検出
Summary
蛍光顕微鏡を使用し、アクティブなカスパーゼ 1 のアダプター、ASC 染色細胞単位で炎症: NLRP3 インフラマソーム活性化の検出について述べる。乳酸脱水素酵素のリリースの試金である人口に基づいて pyroptotic 換散を検出する. します。これらのテクニックは、インフラマソーム生物学の多くの面を調査する合わせることができます。
Abstract
Inflammasomes は、多くの病原体の制御に成功したために必要ですがまた炎症性推進生得の免疫シグナル伝達プラットフォームと, 炎症性疾患です。Inflammasomes は細胞質パターン認識受容体、NOD のような受容体 (NLR) 家族のメンバーを含むによってアクティブ化されます。これらの受容体は、微生物または損傷関連刺激の検出時に oligomerize します。アダプター蛋白質 ASC の後の採用は、近接による自動-活性化を介してカスパーゼ 1 をアクティブにする顕微鏡可視インフラマソーム複雑なを形成します。次の活性化は、カスパーゼ 1 裂く pro il-1 β および pro-イル-18、活性化とこれらの炎症性サイトカインの分泌に 。カスパーゼ 1 は、pyroptosis は、膜の完全性および細胞の換散の損失を特徴と呼ばれる細胞死の炎症性フォームを仲介します。カスパーゼ 1 は、gasdermin D、膜の細孔を形成する N 末端フラグメントを解放浸透圧溶解につながるを裂きます。
In vitroカスパーゼ 1 の活性化は、カスパーゼ 1 の活性プローブ FAM YVAD FMK 骨髄由来マクロファージをラベリングと ASC アダプター蛋白質に対する抗体を用いた細胞の分類によって決定できます。この技法は、インフラマソーム形成および蛍光顕微鏡を用いた細胞のカスパーゼ 1 の活性化を識別できます。Pyroptotic 細胞死は、培地に細胞の乳酸脱水素酵素の放出を測定することによって検出できます。この手順では、単純なコスト効果の高い、スクリーニングのための適応をできるように、96 ウェル プレート形式で行われます。本稿で示すアダプター蛋白質 ASC とカスパーゼ-1 アクティブの共局在のため、nigericin による炎症: NLRP3 インフラマソーム活性化 pyroptosis につながる.
Introduction
インフラマソームを介した炎症病原体1防御の重要なコンポーネントですが、また多くの病気2の病因の基となります。病原体関連分子パターン (PAMPs) ゾル性細胞質の検出による感染症の広い範囲に炎症反応が発生または損傷関連分子パターン (DAMPs)。パターン認識受容体 (PRR)、うなずくような受容体 (NLR) 家族のメンバーを含むは、PAMPs と DAMPs これらの検出時に oligomerize します。これは PRR、アダプター蛋白質 C ターミナル カスパーゼ募集ドメイン (カード) (ASC) とのプロのフォームを含むアポトーシス関連の斑点のようなタンパク質を含んだインフラマソームと呼ばれる複数の蛋白質の複合体の形成をトリガーします。カスパーゼ 13,4。この複合体では、近接による自動-カスパーゼ 1 の活性化ことができます。アクティブなカスパーゼ 1 は、一連の炎症性細胞死経路 pyroptosis の特徴であるイベントにつながります。これらのイベントが含まれます: 胸の谷間と炎症性サイトカイン il-1 と IL-18、細胞外領域、核の凝縮、gasdermin D 胸の谷間にリソソーム内容のリリースでリソソーム エキソサイトーシスのリリース。Gasdermin D のリリースされた N 末端ドメインは、細胞膜、細胞膜の破断と病原体複製5,のための保護ニッチを奪うだけでなく、炎症性の内容のリリースを引き起こす毛穴に挿入します6,7。
ここでは、我々 はよく研究炎症: NLRP3 インフラマソームに焦点を当てます。炎症: NLRP3 インフラマソーム活性化は、8段階のプロセスを介して行われます。「プライミング」最初ステップは、微生物製品の Toll 様受容体 (TLR) によって認識を介して行われます。これは実験室の設定で TLR4 を刺激する LP を使用してレプリケートされます。この刺激 upregulates 炎症: NLRP3 と pro il-1 Nf-kb がシグナル伝達を介した。またプライミング脱9,10とリン酸化または特定の残基11,12の脱燐酸化を誘導することによって非転写メカニズムを通じて炎症: NLRP3 をライセンスします。
炎症: NLRP3 活性化のため 2 つ目の信号は、とらえどころのない8のまま炎症: NLRP3 活性化のための統一機構がカルシウム、カリウム排出、活性酸素種ミトコンドリア因子を含むと考えられます。活性化された炎症: NLRP3 そのナハト ドメイン間の相互作用を介して oligomerizes、pyrin (PYD) ドメイン13のバインディングによって ASC を募集します。各セルにこれらの高分子複合体は単一の顕微鏡的表示フォーカスを形成します。ASC はもともとひと白血病細胞のアポトーシスの間に「染み」を形作る 22 KDa タンパク質とカード14を含む名前付きのアポトーシス関連斑点のようなタンパク質として同定されました。ASC は、pro-カスパーゼ-1 インフラマソーム15を形成プロ-カスパーゼ-1 のカードと ASC のカードとの相互作用を通じて募集がわかった。
すべての NLRs は、カスパーゼ 1 の活性化を誘導するために ASC の存在を必要とします。炎症: NLRP3 とは異なり NLRC4 と NLRP1b カード ドメインがあり、直接プロ-カスパーゼ-1 カスパーゼ 1 の活性化を誘導するために – カード相互作用を採用できます。ASC がない場合は、アクティブなカスパーゼ 1 細胞質を通じて拡散ままで、単焦点を形成していません。このびまん性のアクティブなカスパーゼ 1 が pyroptotic 細胞死を誘導するのに十分なプロ il-113,16を処理することはありません。
本稿では、インフラマソーム活性化を評価するために 2 つの方法を説明します。最初は、蛍光のアクティビティを使用してプローブ、FAM-YVAD-FMK、プロテアーゼのカスパーゼ 1 家族を結合します。この家族には、カスパーゼ 1、またマウス カスパーゼ-11 と人間カスパーゼ-4 とカスパーゼ 5 が含まれています。カスパーゼ-1/11 欠損マウスのマクロファージを使用して、すべての実験で、このプローブの特異性に対処されます。このメソッドは、抗体のも説明インフラマソームのコンポーネントの分類と組み合わせることができます。可視化は、アクティブなカスパーゼ 1 と低分子化 ASC を含む個々 のセルの識別のためことができます。このメソッドを使用して、研究者は、インフラマソーム形成カスケード効果がある宿主細胞や病原体研究の下の彼らの操作を決定することができます。たとえば、1 つは特定の介入が複雑な炎症: NLRP3 に ASC の採用を防ぐことができますまたは17カスパーゼ 1 の活性化とその後の採用ターゲットかどうかを区別できます。Il-1 β の分泌などカスパーゼ 1 の活性化の結果を調べることがこれらの 2 つの状況を区別することができません。また、il-1 β の分泌は、カスパーゼ 1 をアクティブにし、pyroptotic 細胞死16を受ける細胞の機能を変えることがなく変更できます。
2 番目のメソッドは、前述のように、カスパーゼ 1 の活性化を次 pyroptotic 大食細胞換散の中に発生する細胞培養上清への乳酸脱水素酵素 (LDH) の放出を測定します。この 2 番目の方法は、全体で LDH のリリースも測定は人口ベースのアプローチです。この単純なアプローチは試料の迅速分析 (インキュベーション時間の 30 分) カスパーゼ 1 を介した細胞死があるかを判断することができ、96 ウェル プレート形式で実行することができます。
これらのメソッドは、補完的なそれぞれ異なる利点との両方が簡単に変更の影響を受けやすい。たとえば、インフラマソーム刺激前にターゲットを絞った小さな分子量化合物によるマクロファージ治療は炎症反応を制御するタンパク質が特定の役割を調査するため使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿では、我々 はインフラマソーム活性化とマウス骨髄由来マクロファージの炎症: NLRP3 刺激カスパーゼ 1 の活性化の結果を確認する 2 つの手法を提案しました。最初のテクニックでは、蛍光レポーター FAM YVAD FMK を使用して携帯電話にカスパーゼ 1 の活性化のレベルを決定する研究者をことができます。この記者は、カスパーゼ-1/11 欠損マクロファージの染色の有無によって見られる酵素?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
すべての顕微鏡は、w. m. ケック顕微鏡センター ナサニエル ・ ピーターズのサポートと NIH 賞 S10OD016240 のサポートで行われました。S.L.F. をサポートするには、NIH の K08AI119142 と R21AI130281。博士リチャード Flavell とカスパーゼ-1/11 欠損マウスの博士ブラッド Cookson と博士ブラッド Cookson 研究室設備・機器を共有するために感謝します
Materials
| E-MEM | ATCC | 30-2003 | For growing L929 cells |
| NCRC clone 929 (L929) | ATCC | CCL-1 | |
| Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | Includes fixation and permeabilization solution, and wash buffer. Proprietary formulations. Contains 4.2% formaldehyde |
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Cytotox96 Nonradioactive cytotoxicity assay | Fisher Scientific | PR-G1780 | Includes Substrate Mix and Assay Buffer; Proprietary formulations. Stop solution is 1 M Acetic acid |
| FAM-YVAD-FMK | Immunocytochemistry Technologies | 98 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Invitrogen | 11960044 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Invitrogen | 31053028 | |
| Dulbecco's PBS, no calcium, no magnesium | Invitrogen | 14190144 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin | Invitrogen | 26140079 | Heat inactivated at 55°C for 50 min |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750060 | |
| ProLong Gold Mounting Medium | Invitrogen | p36934 | Proprietary formulation. Curing mounting medium. Hardens to refractory index of 1.46 |
| goat anti-mouse ALEXA555 | Invitrogen | A-21422 | |
| HEPES (Ultra Pure) | Invitrogen | 11344041 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 21051024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| TO-PRO-3 Iodide | Invitrogen | T3605 | far-red fluorescent nucleic acid stain |
| C57BL/6J mouse | Jackson Laboratoy | 000664 | |
| caspase-1/11-/- mouse | Jackson Laboratory | 016621 | |
| Leica SP8X Confocal Microscope | Leica | ||
| Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re) | List Biologicals | 434 | |
| anti-ASC clone 2EI-7 | Millipore-Sigma | 04-417 | |
| beta-mercapto-ethanol | Millipore-Sigma | M6250-10ML | |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650-5X10ML | |
| EDTA | Millipore-Sigma | E5391 | |
| Spectramax M3 plate reader | Molecular Devices | 5000414 |
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