小鼠骨髓源性巨噬细胞 Inflammasome 活化和 Pyroptotic 细胞死亡的检测
Summary
我们描述了 NLRP3 inflammasome 激活的细胞基础上的荧光显微镜和染色的主动 caspase-1 和适配器, ASC。以乳酸脱氢酶释放试验为依据, 检测 pyroptotic 裂解的人群。这些技术可以适应研究 inflammasome 生物学的许多方面。
Abstract
Inflammasomes 是先天免疫信号平台, 是成功控制许多致病有机体所必需的, 同时也促进炎症和 autoinflammatory 疾病。Inflammasomes 由胞浆模式识别受体激活, 包括点头样受体 (NLR) 家族的成员。这些受体 oligomerize 对微生物或损伤相关刺激的检测。随后, 适配器蛋白 ASC 的招募形成了一个显微镜可见的 inflammasome 复合体, 通过接近诱导的自动激活激活 caspase-1。活化后, caspase-1 pro-IL-1β和 pro-IL-18, 导致这些促炎性细胞因子的活化和分泌。Caspase-1 还介导细胞死亡的炎症形式称为 pyroptosis, 其特征是膜完整性的丧失和细胞裂解。Caspase-1 gasdermin D, 释放形成等离子膜孔隙的 N 末端片段, 导致渗透裂解。
体外, caspase-1 的活化可以通过标记骨髓源性巨噬细胞与 caspase-1 活动探针 YVAD (芬兰马克来确定, 并通过对适配器蛋白 ASC 的抗体对细胞进行标记。这种技术可以通过荧光显微镜识别单个细胞中的 inflammasome 形成和 caspase-1 活化。Pyroptotic 细胞死亡可以通过测量胞浆乳酸脱氢酶释放到培养基中来检测。该程序简单, 成本效益高, 并以96井板格式进行, 允许适应筛选。在这篇手稿中, 我们展示了 NLRP3 inflammasome 的活化尼日利亚菌素导致了适配器蛋白 ASC 和主动 caspase-1 的共同定位, 导致 pyroptosis。
Introduction
Inflammasome 介导的炎症是防御病原生物的一个关键组成部分1, 但也构成许多疾病的病因2。炎症反应的广泛感染是由胞浆检测病原体相关的分子模式 (PAMPs) 或损害相关的分子模式 (抑) 触发。模式识别受体 (PRR), 包括点头样受体 (NLR) 家族的成员, oligomerize 在这些 PAMPs 和抑的检测。这触发了一个多蛋白复合体的形成, 称为 inflammasome, 其中包含 PRR, 适配器蛋白凋亡相关的斑点样蛋白, 含有 C 终端 caspase-招聘领域 (ASC), 和赞成形式的caspase-13,4。这一复杂的 caspase-1 允许接近诱导的自动激活。活跃的 caspase-1 然后导致一组事件是炎症细胞死亡途径 pyroptosis 的特征。这些事件包括: 炎症细胞因子 IL-1β和 IL-18 的分裂和释放, 溶酶体胞吐作用释放溶酶物的内容进入细胞外空间, 核冷凝和 gasdermin D 分裂。释放的 N 端域 gasdermin D 插入到等离子膜, 形成毛孔, 导致等离子膜破裂和释放炎症的内容, 除了带走一个保护生态位的病原体复制5,6,7。
在这里, 我们专注于研究良好的 NLRP3 inflammasome。NLRP3 inflammasome 的激活是通过两步过程8进行的。第一个 “启动” 步骤是通过对一种微生物产品的类似收费受体 (TLR) 的识别而产生的。这是复制在实验室设置使用 LPS 刺激 TLR4。这种刺激上调 NLRP3 和 pro-IL-1β通过 NF-kB 信号。另外启动许可证NLRP3 通过非转录机制诱导其 deubiquitination9,10和磷酸化或除磷的特定残留 11, 12。
NLRP3 激活的第二个信号被认为涉及线粒体因素、活性氧种类、钾外流和钙信号, 尽管 NLRP3 激活的统一机制仍然难以捉摸8。激活 NLRP3 oligomerizes 通过其晚上域之间的交互, 并通过 pyrin (PYD) 域13的绑定来招募 ASC。在每个细胞中, 这些大分子复合物形成一个单显微镜可见的焦点。ASC 最初被确定为 22 KDa 蛋白, 在人类白血病细胞凋亡期间形成 “斑点”, 并命名为凋亡相关的斑点状蛋白, 含有卡14。后来确定, asc 新兵 pro-caspase-1 通过与 pro-caspase-1 卡的互动, 形成 inflammasome15。
并非所有 NLRs 都需要 ASC 的存在来诱导 caspase-1 激活。与 NLRP3 不同, NLRC4 和 NLRP1b 具有卡域, 可以通过卡卡交互直接招聘 pro-caspase-1, 以诱导 caspase-1 激活。在没有 ASC 的情况下, 活跃的 caspase-1 在整个细胞质中仍然弥漫, 并不形成一个单一的焦点。这种弥散活性 caspase-1 足以诱发 pyroptotic 细胞死亡, 但无法处理 pro-IL-1β13,16。
在这篇手稿中, 我们将讨论两种评估 inflammasome 激活的方法。第一个使用荧光活性探针, YVAD-(芬兰马克, 它结合了 caspase-1 家族的蛋白酶。这个家庭包括 caspase-1, 还有老鼠 caspase-11 和人类 caspase-4 和 caspase-5。通过在所有实验中使用 caspase-1/11 缺陷小鼠的巨噬细胞, 可以解决该探针的特异性。该方法可与 inflammasome 成分的抗体标记相结合, 并对其进行描述。显微可视化可以识别含有活性 caspase-1 和 oligomerized 的单个细胞。利用这一方法, 研究人员将能够确定在 inflammasome 形成级联他们的宿主细胞的操作或所研究的致病有机体的作用。例如, 可以区分某一特定的干预是否阻止了 NLRP3 复合体的招募, 或者是针对随后的 caspase-117的招募和激活。检查 caspase-1 激活的结果, 如 IL-1β分泌物, 将无法区分这两种可能性。此外, IL-1β的分泌可以改变, 而不改变细胞激活 caspase-1 的能力, 并接受 pyroptotic 细胞死亡16。
第二种方法测量乳酸脱氢酶 (LDH) 的释放到细胞上清, 这是发生在 pyroptotic 巨噬细胞裂解后, caspase-1 激活, 如上文所述。这第二种方法是以人口为基础的方法, 因为在整个油井中乳酸脱氢酶的释放量被测量。这种简单的方法允许快速分析 (30 分钟的潜伏期) 的样本, 以确定是否有 caspase-1-mediated 细胞死亡, 并可以执行96井板格式。
这些方法是互补的, 每个都有不同的优点, 而且两者都易于修改。例如, 在 inflammasome 刺激之前, 用靶向小分子量化合物的巨噬细胞治疗可以用来研究某些蛋白质在控制炎症反应方面可能具有的作用。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这篇手稿中, 我们提出了两种技术来检查 inflammasome 活化和 NLRP3 刺激后 caspase-1 活化的结果在小鼠骨髓源性巨噬细胞。第一种技术允许研究者使用荧光报告器 YVAD-(芬兰马克来确定细胞基础上的 caspase-1 活化水平。这个记者是高度特异的结合 caspase-1 家族的酶, 看不见染色 caspase-1/11 缺乏的巨噬细胞。特异性也显示了 LaRock et al。在他们的手稿中描述了耶尔森氏菌蛋白 YopM 对 caspase-1 活化…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
所有显微术都是在萨克雷的凯克显微镜中心进行的, 并得到了 S10OD016240 的支持。S.L.F. 得到 NIH K08AI119142 和 R21AI130281 的支持。我们感谢理查德 Flavell 博士和布拉德库克森博士为 caspase-1/11 不足的老鼠, 和布拉德博士库克森共享实验室设施和设备。
Materials
| E-MEM | ATCC | 30-2003 | For growing L929 cells |
| NCRC clone 929 (L929) | ATCC | CCL-1 | |
| Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | Includes fixation and permeabilization solution, and wash buffer. Proprietary formulations. Contains 4.2% formaldehyde |
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Cytotox96 Nonradioactive cytotoxicity assay | Fisher Scientific | PR-G1780 | Includes Substrate Mix and Assay Buffer; Proprietary formulations. Stop solution is 1 M Acetic acid |
| FAM-YVAD-FMK | Immunocytochemistry Technologies | 98 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Invitrogen | 11960044 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Invitrogen | 31053028 | |
| Dulbecco's PBS, no calcium, no magnesium | Invitrogen | 14190144 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin | Invitrogen | 26140079 | Heat inactivated at 55°C for 50 min |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750060 | |
| ProLong Gold Mounting Medium | Invitrogen | p36934 | Proprietary formulation. Curing mounting medium. Hardens to refractory index of 1.46 |
| goat anti-mouse ALEXA555 | Invitrogen | A-21422 | |
| HEPES (Ultra Pure) | Invitrogen | 11344041 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 21051024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| TO-PRO-3 Iodide | Invitrogen | T3605 | far-red fluorescent nucleic acid stain |
| C57BL/6J mouse | Jackson Laboratoy | 000664 | |
| caspase-1/11-/- mouse | Jackson Laboratory | 016621 | |
| Leica SP8X Confocal Microscope | Leica | ||
| Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re) | List Biologicals | 434 | |
| anti-ASC clone 2EI-7 | Millipore-Sigma | 04-417 | |
| beta-mercapto-ethanol | Millipore-Sigma | M6250-10ML | |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650-5X10ML | |
| EDTA | Millipore-Sigma | E5391 | |
| Spectramax M3 plate reader | Molecular Devices | 5000414 |
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