Assemblaggio e purificazione del prototipo Virus schiumoso Intasomes
Summary
Integrasi retrovirale recombinante e oligomeri del DNA che imita le estremità del DNA virale possono formare un complesso enzimaticamente attivo conosciuto come un intasome. Intasomes possono essere utilizzati per studi biochimici, strutturali e cinetici. Questo protocollo i dettagli di come assemblare e purificare prototipo schiumoso virus intasomes.
Abstract
A definire funzionalità e necessario passaggio del ciclo di vita di retrovirus è l’integrazione del genoma virale nel genoma ospite. Tutti i retrovirus codificare un enzima integrasi (IN) che catalizza l’Unione covalente di virale all’host del DNA, che è conosciuto come trasferimento di filo. Integrazione può essere modellato in vitro con ricombinante IN retrovirali e oligomeri di DNA che imita le estremità del genoma virale. Per ricapitolare maggiormente la reazione di integrazione che si verifica in vivo, integrazione complessi sono assemblati da ricombinante IN e oligomeri sintetici da dialisi in un buffer di ridotta concentrazione di sale. L’integrazione complessa, detta un intasome, può essere purificato da cromatografia di esclusione di formato. Nel caso di virus schiumoso del prototipo (PFV), il intasome è un tetramero di IN e due DNA oligomeri e prontamente è separato dal IN monomerico e gratuito oligomero del DNA. L’efficienza di integrazione di PFV intasomes può essere dosato con una varietà di condizioni sperimentali per meglio comprendere le dinamiche e la meccanica dell’integrazione retrovirale.
Introduction
Integrazione del genoma virale nel genoma ospite è un passaggio obbligatorio nel ciclo di vita di tutti i retrovirus1. L’enzima virale dell’integrasi (IN) catalizza l’Unione covalente di ciascuna estremità del genoma del DNA virale per l’host del DNA. Durante un’infezione cellulare, fa parte di un complesso di pre-integrazione che media integrazione IN. Ricombinante IN complessato con oligomeri del DNA incagliati doppi che imita le estremità del DNA virale può anche eseguire l’integrazione in una destinazione del DNA in vitro2. Una comune integrazione test in vitro utilizza un plasmide supercoiled il DNA dell’obiettivo. Integrazione di entrambi oligomeri del DNA virali (vDNA) per il plasmide si traduce in un prodotto lineare e viene definito integrazione concertata (Figura 2A). L’integrazione test in vitro può anche produrre prodotti con un solo vDNA covalentemente unita al plasmide di destinazione risultante in un cerchio rilassato. Questo prodotto di integrazione del metà-sito sembra essere un manufatto del analisi in vitro.
Ricombinante IN e vDNA possono effettuare integrazione in vitro, ma non sono i reagenti ideali per lo studio delle dinamiche o la struttura dei complessi di integrazione quando IN monomerico oscurerebbero visualizzazione pertinenti. Sono necessari per gli studi strutturali o analisi dinamica singola molecola purificata integrazione complessi, o “intasomes,”. PFV IN e vDNAs possono essere assemblati da dialisi da un buffer relativamente alta concentrazione di sale a una bassa concentrazione di sale3,4. Durante la dialisi, un precipitato forme. Questo precipitato è rimosso dalla dialisi e la concentrazione di sale è aumentata. La concentrazione di sale superiore solubilizza il precipitato contenente PFV intasomes. La intasomes quindi sono purificati mediante cromatografia di esclusione di formato (SEC). Ricombinante prototipo virus schiumoso (PFV) IN ha dimostrato di esistere come un monomero in soluzione a concentrazioni fino a 225 µM5. Frazionamento di SEC separa efficacemente il intasomes PFV (225,5 kDa), che comprende un tetramero di PFV IN e due vDNAs, da monomerico PFV IN (44,4 kDa) e gratuito vDNA (24.0 kDa). Il intasomes PFV possono essere congelati e mantenere attività di integrazione per almeno sei mesi di conservazione a-80 ° c.
Ricombinante PFV intasomes possono anche essere modificate per includere IN sostituzioni dell’amminoacido o mutazioni di troncamento o vDNAs etichettato con fluorofori o biotina4,6. Il intasomes PFV purificata eseguire prontamente l’integrazione in un target di plasmide supercoiled DNA in vitro. Saggi biochimici integrazione alla rinfusa con intasomes possono testare gli effetti delle mutazioni, IN inibitori o altri additivi chimici. Biotinilati intasomes può essere utilizzato per sondare affinità con acidi nucleici o proteine. PFV intasomes sono funzionali a temperatura ambiente, permettendo per analisi di microscopia di singola molecola di pinzette magnetiche per misurare il tempo tra la giunzione dei due vDNA punte o fluorescenza di riflessione interna totale per visualizzare la ricerca di intasome sul bersaglio DNA6. Inoltre, PFV intasomes sono stati i primi ad essere strutturalmente caratterizzato impattare significativamente il campo di integrazione retrovirale3.
Protocol
Representative Results
Discussion
Retrovirali INs formano un complesso con il DNA di genomic virale per eseguire l’integrazione e continuare il ciclo di vita virale multimerico. Il numero di nei monomeri per intasome può essere tetrameri, octamers o possibilmente più alto ordine multimeri11,12,13,14. PFV intasomes sono un tetramero di ricombinante con oligomeri di DNA double-stranded che imitano DNA genomic virale finisce<sup…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da NIH AI099854 e AI126742 a chiave.
Materials
| DNA Oligomers | IDT | N/A | Custom DNA Oligos |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | Sigma-Aldrich | Z677094-24EA | 3 kDa MWCO |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G37-20 | |
| Gel-loading tips, 1 – 200 μL | Corning | CLS4853-400EA | |
| Razor blade; Single-edged; 100/Pk.; Pack of 100 | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 568-0020 | |
| Dialysis tubing clips | Spectrum Labs | 132734 | |
| 6-8 kDa 10 mm Dialysis Tubing | Spectrum Medical | 132645 | |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517201 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Hyladder 10kb, 500 lanes | Denville Scientific | CB4225-4 |
References
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. . Retroviruses. , (1997).
- Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).
- Hare, S., Gupta, S. S., Valkov, E., Engelman, A., Cherepanov, P. Retroviral intasome assembly and inhibition of DNA strand transfer. Nature. 464 (7286), 232-236 (2010).
- Li, M., Lin, S., Craigie, R. Outer domains of integrase within retroviral intasomes are dispensible for catalysis of DNA integration. Protein Sci. 25 (2), 472-478 (2016).
- Gupta, K., et al. Solution conformations of prototype foamy virus integrase and its stable synaptic complex with U5 viral DNA. Structure. 20 (11), 1918-1928 (2012).
- Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nat Commun. 7, 11409 (2016).
- Lopez, M. A., Mackler, R. M., Altman, M. P., Yoder, K. E. Detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Vis Exp. , (2017).
- Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
- Poirier, M. G., Bussiek, M., Langowski, J., Widom, J. Spontaneous access to DNA target sites in folded chromatin fibers. J Mol Biol. 379 (4), 772-786 (2008).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Ballandras-Colas, A., et al. Cryo-EM reveals a novel octameric integrase structure for betaretroviral intasome function. Nature. 530 (7590), 358-361 (2016).
- Ballandras-Colas, A., et al. A supramolecular assembly mediates lentiviral DNA integration. Science. 355 (6320), 93-95 (2017).
- Passos, D. O., et al. Cryo-EM structures and atomic model of the HIV-1 strand transfer complex intasome. Science. 355 (6320), 89-92 (2017).
- Yin, Z., et al. Crystal structure of the Rous sarcoma virus intasome. Nature. 530 (7590), 362-366 (2016).
- Maertens, G. N., Hare, S., Cherepanov, P. The mechanism of retroviral integration from X-ray structures of its key intermediates. Nature. 468 (7321), 326-329 (2010).
- Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).
