Otomatik slayt tarama ve segmentasyon Fluorescently etiketli dokularda Widefield yüksek-içeriği analiz sistemi kullanılarak
Summary
Burada bir widefield yüksek-içerik analizi sistemi (WHCAS) kullanarak slaytlarda fluorescently etiketli dokuların otomatik bölümleme için bir protokol açıklayın. Bu iletişim kuralının Nefelometri biyolojik bilimler, tıbbi mühendislik ve Sağlık Bilimleri de dahil olmak üzere biyolojik dokularda floresan işaretleri içeren herhangi bir alanda geniş kapsamlı uygulamalar vardır.
Abstract
Slayt tarama otomatik ve segmentasyon dokuların fluorescently etiketli tüm slaytları veya büyük doku bölümleri analiz etmek için en etkili yoludur. Ne yazık ki, pek çok araştırmacı zaman ve kaynak geliştirme ve iş akışları yalnızca kendi deneyleri için uygun olan en iyi duruma getirme büyük miktarda harcama. Bu makalede, biz bu widefield yüksek-içerik analizi sistemine (WHCAS) erişim ile ilişkili yazılımı bulunan önceden inşa edilmiş modüller içinde özelleştirme seçenekleri ile slayt monte edilmiş herhangi bir doku görüntü için kullanılan bir iletişim kuralı tanımlamak. Özgün olarak slayt tarama için amaçlanan, bu makalede ayrıntılı adımları ilişkili yazılım ithal WHCAS Albümdeki tarama slayt alma olanağı olun. Bu örnekte, beyin tümörü slaytları otomatik ayrılmasını gösterdi ama herhangi bir fluorescently etiketli nükleer veya sitoplazmik işaretçisi otomatik ayrılmasını mümkündür. Ayrıca, protein yerelleştirme/translocation, hücresel proliferasyonu/canlılık/Apoptozis ve çalıştırılabilir angiogenez deneyleri de dahil olmak üzere diğer nicel yazılım modülleri çeşitli vardır. Bu teknik araştırmacılar zaman ve emek tasarrufu ve slayt analiz için otomatik bir iletişim kuralı oluşturun.
Introduction
Slaytlarda fluorescently etiketli dokuların doğru ve hassas Nefelometri çok bilimsel alanda çok aranan bir tekniktir. Ancak, araştırmacılar genellikle el ile numune saymak veya bunu başarmak için ezoterik otomatik teknikleri geliştirmek zaman önemli miktarda harcama. Burada, otomatik slayt tarama ve Nefelometri donmuş insan beyin tümörü bölümlerde örnek olarak doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ile bir WHCAS ve onun ilişkili yazılım kullanarak hücre için bir protokol sağlar. İlişkili yazılım farklılaşma hücre türleri1,2,3,4,5, için sayma neurite çıkıntı dahili özelleştirilebilir modülleri çeşitli teklifler 6. bu yöntem amacı araştırmacılar görüntülerini almak ve herhangi bir slayt monte edilmiş dokular fluorescently etiketli varlıklarda quantitate için bir başlangıç bitiş, kolayca tekrarlanabilir protokol sağlamaktır.
Bu protokol için WHCAS esas olarak bir slayt bağdaştırıcısı ve temel tarama7 slayt için kullanılabilir olmasına rağmen plakalar ilişkili yazılım üzerinde daha sonraki analiz için görüntüleme için kullanılır. Dikkat et kayma kalibrasyon satın alan, uygun dergi seçimi, özel loadouts oluşturulması ve ürün temsilcileri ile bir irtibat olduğu için gerekli görüntü slaytlara engelleyici. Edebiyat bir özel slayt görüntüleme ve analiz cihazları8, satın alma yerine, daha geniş vücuttaki bu yazılım erişimi olan bir önceki teknolojik rapor slaytlar WHCAS tamamen9resim alma atlatılabilirdi. Görüntü edinme veya görüntü farklı platformlarda çözümlemesini her ile diğer uyumlu olduğundan emin olmak için fazladan iş gerektirir.
Görüntü yakalama için WHCAS ve onun bilgisayar yazılımı kullanma yeteneğini arama veya bir iş akışı yabancı bu araçlar geliştirme gereksiz komplikasyonları önlemek olacaktır. Bu makalede, slaydı bir tabak gibi davranarak bir düşük büyütme genel bakış tarama ve karşılık gelen yüksek büyütme görüntüler oluşturmak için gereken adımları ve çoklu dalga boyu hücre puanlama segmentasyon modülü kullanılarak daha sonraki analizler için izin ver WHCAS repurposing. Görüntüleri üzerinde WHCAS elde bir kez algoritmaları veya çok adımlı sayım protokolleri10,11 geliştirmek gerek yok çünkü bu kolayca kullanılabilir iletişim kuralı alternatif teknikleri üzerinde bir avantaj sağlar. Bu iletişim kuralı bir Nefelometri tekniği en iyi duruma getirmek için gereken süreyi azaltır, daha hassas12 ‘ dir ve elle sayım daha verimli ve WHCAS kullanımını en üst düzeye çıkarır. Görüntüleme ve çözümleme slaytlar üzerindeki herhangi bir fluorescently etiketli dokuların sağlar beri bu protokolü yaygın olarak ve kolayca kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biyolojik bilim araştırma etkinliğini engelleyen ortak bir sorun hala fluorescently etiketli dokuların tarafsız, doğru ve kesin miktar ve kendi yapıları içinde için protokoller gelişmedir. Önemli miktarda zaman ve çaba bir kez onlar görüntüsü doku slaytlar analiz etmek için yollar bulmak doğru yönlendirilir. Birçok mevcut yöntemleri algoritmaları kullanıcıların programları12,13,14içinde yeniden oluşturmak sağlar. Bu yöntemler kabul edilebilir, ama kolayca ve hızlı bir şekilde bir bütünsel resim alma ve Çözümleme Protokolü kullanıcı erişimi bir WHCAS varsa kurmak kullanıcı sağlar bu raporu önem taşıyor. Örneğin, hücre tiplerinin ayırt etmek ve birden fazla yapıları ve süreçleri, hücre döngüsü analizi ve nükleer translocation, ölçmek deneyleri zaten ilişkili yazılım mevcuttur.
Kurulum birkaç kritik adımları içerir. İlk olarak, bir tabak sanki gibi slaydın kayma parametreleri tanımlanır. İkinci olarak, bir düşük büyütme genel bakış tarama faiz bölgelerinde yüksek büyütme görüntüleme için seçileceği oluşturulur. Son olarak, doğruluk ve sonraki analizlerin duyarlığını etkileyen siteler hariç tutulur. Bu tekniğin büyük sınırlama onun uygulanabilirliği kullanıcının erişim için bir WHCAS sahip olup olmadığını bağlıdır. Ancak, yüksek-içeriği analiz sistemleri için artan ihtiyaç ile birçok kurum bunlar rekabet15kalmak için onların araştırmacılar için sağlıyor. Doku bölümler aynı kalınlığı varken sorun giderme en çok gereklidir. Birden çok bölge ilgi seçtiyseniz, süre diğer-ecek değil bazı odak olacaktır. İdeal olarak, kesit sırasında kullanıcı homojen örnekleri oluşturmak için dikkat çekmek. Ancak, örnekleri tutarsız varsa, odak için kullanılan nükleer leke dalga boyu (veya kullanıcının en parlak fluorophore) odaklı ayarlamalara gidilmesi her odak bölge ilgi ve görüş her alan için bile. Diğer dalga boylarında sadece nükleer leke dalga boyu mahsup edilir gibi sadece bu dalga boyu uygulayabilecek ihtiyacı var.
Bu raporda, biz ayrıntılı nasıl tarama ve bir WHCAS ve ilişkili yazılım kullanarak slaytları analiz için. Çoklu dalga boyu hücre puanlama modülü fluorescently etiketi olan herhangi bir nükleer veya sitoplazmik işaretleri otomatik olarak saymak kullanıcı sağlar. Odak ayarlarını yaparak ve genişlik ve yansıma doku modülü özelleştirmek için alanı gibi hücresel özelliklerini tanımlayan sonra daha fazla kullanıcının araya girmesi görüntülü slayt ve nicel veri elde etmek için gerek yoktur. Bir anda en çok üç slayt yansıması ve ilgi birden fazla bölgesini tanımlanabilir. Slaytlar analiz etmek gerekir WHCAS kullanıcılar özelleştirilebilir, çok amaçlı, yararlanmak bu protokolü sağlar küçük hiçbir optimizasyonu gerektirir ve histolojik dokusu analizini içeren herhangi bir projelerde gelecekte uygulanacak iş akışları otomatik.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu proje bir hibe Kanada Sağlık Araştırma enstitüleri ve Alberta yeniliklerin – sağlık çözümleri/Alberta kanser Vakfı tarafından finanse edildi. Yazarlar rejenerasyon birim Nörobiyoloji çekirdek tesiste Vakfı bunun üzerine WHCAS tarama slaytta mümkün yapıldı ve ürünlerin yaratıcısı binada Paula Gedraitis çalışmalarını kendi ekipman kullanımı için kabul etmek istiyorum Bu makalede, moleküler aygıt belirtilen.
Materials
| ImageXpress MicroXLS | Molecular Devices | NA | Apparatus for image acquisition |
| MetaXpress 5.1 | Molecular Devices | NA | Associated software for ImageXpress MicroXL (runs on a PC with the Windows operating system). |
| Slide adapter | Molecular Devices | NA | Metal slide holder that fits into ImageXpress MicroXL |
| Slide_Region_Acquisition_revA.jzp | Molecular Devices | NA | The journal can be obtained from metamorph.moleculardevices.com/forum/showthread.php?tid=218&highlight=slide or from contacting a Molecular Devices representative |
| Slide_Region_Acquisition_Setup.JNL | Molecular Devices | NA | Select this journal in Step 6.6. |
References
- Hua, Y., Shun, T. Y., Strock, C. J., Johnston, P. A. High-content positional biosensor screening assay for compounds to prevent or disrupt androgen receptor and transcriptional intermediary factor 2 protein-protein interactions. Assay and Drug Development Technologies. 12 (7), 395-418 (2014).
- Rishal, I., et al. WIS-NeuroMath enables versatile high throughput analyses of neuronal processes. Developmental Neurobiology. 73 (3), 247-256 (2013).
- Kanungo, J., Lantz, S., Paule, M. G. In vivo imaging and quantitative analysis of changes in axon length using transgenic zebrafish embryos. Neurotoxicology and Teratology. 33 (6), 618-623 (2011).
- Schurmann, C., et al. Analyzing illumina gene expression microarray data from different tissues: methodological aspects of data analysis in the MetaXpress Consortium. PLoS ONE. 7 (12), e50938 (2012).
- Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. Journal of Visualized Experiments. (40), e1900 (2010).
- Bravo-San Pedro, J. M., et al. High-throughput quantification of GFP-LC3+ dots by automated fluorescence microscopy. Methods in Enzymology. , 71-86 (2017).
- Varga, V. S., et al. Automated multichannel fluorescent whole slide imaging and its application for cytometry. Cytometry Part A. 75 (12), 1020-1030 (2009).
- Narayan, P. J., et al. Assessing fibrinogen extravasation into Alzheimer’s disease brain using high-content screening of brain tissue microarrays. Journal of Neuroscience Methods. 247, 41-49 (2015).
- Du, Y., Budman, H. M., Duever, T. A. Segmentation and quantitative analysis of apoptosis of Chinese hamster ovary cells from fluorescence microscopy images. Microscopy and Microanalysis. 23 (3), 569-583 (2017).
- Mueller, J. L., et al. Quantitative segmentation of fluorescence microscopy images of heterogeneous tissue: application to the detection of residual disease in tumor margins. PLoS One. 8 (6), e66198 (2013).
- Donnelly, D. J., Gensel, J. C., Ankeny, D. P., van Rooijen, N., Popovich, P. G. An efficient and reproducible method for quantifying macrophages in different experimental models of central nervous system pathology. Journal of Neuroscience Methods. 181 (1), 36-44 (2009).
- Kozlowski, C., Weimer, R. M. An automated method to quantify microglia morphology and application to monitor activation state longitudinally in vivo. PLoS One. 7 (2), e31814 (2012).
- Fish, K. N., Sweet, R. A., Deo, A. J., Lewis, D. A. An automated segmentation methodology for quantifying immunoreactive puncta number and fluorescence intensity in tissue sections. Brain Research. 1240, 62-72 (2008).
- Zock, J. M. Applications of high content screening in life science research. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (9), 870-876 (2009).
