Geautomatiseerde dia scannen en segmentatie in Fluorescently-geëtiketteerden weefsels met behulp van een analysesysteem Widefield High-inhoud
Summary
Hier beschrijven we een protocol voor de automatische segmentatie van fluorescently geëtiketteerde weefsels op dia’s met behulp van een widefield high-inhoudsanalyse systeem (WHCAS). Dit protocol heeft brede toepassingen op elk gebied waarbij de kwantificatie van fluorescente markeringen in biologische weefsels waaronder de biologische wetenschappen, medische techniek en Gezondheidswetenschappen.
Abstract
Geautomatiseerd dia scannen en segmentatie van fluorescently-geëtiketteerden weefsels is de meest efficiënte manier voor het analyseren van de hele dia’s of grote weefselsecties. Helaas, veel onderzoekers besteden grote hoeveelheden van tijd en middelen ontwikkelen en optimaliseren van werkstromen die alleen relevant voor hun eigen experimenten zijn. In dit artikel beschrijven we een protocol dat kan worden gebruikt door degenen met toegang tot een widefield high-inhoudsanalyse systeem (WHCAS) om het imago van elke dia gemonteerde weefsel, met opties voor aanpassing binnen voorgebouwde modules gevonden in de bijbehorende software. Niet oorspronkelijk voorgenomen voor dia scannen, maken de stappen in dit artikel beschreven het mogelijk te verwerven dia scannen afbeeldingen in de WHCAS die kunnen worden geïmporteerd in de bijbehorende software. In dit voorbeeld wordt de automatische segmentatie van hersenen tumor dia’s is aangetoond, maar de automatische segmentatie van elke fluorescently-geëtiketteerden nucleaire of cytoplasmatische marker is mogelijk. Verder zijn er een verscheidenheid van andere kwantitatieve softwaremodules, met inbegrip van tests voor eiwit localisatie/translocatie, cellulaire proliferatie/levensvatbaarheid/apoptosis en angiogenese die kunnen worden uitgevoerd. Deze techniek zal onderzoekers tijd en moeite besparen en een geautomatiseerde protocol voor de analyse van de dia maken.
Introduction
De nauwkeurige en precieze kwantificatie van fluorescently-geëtiketteerden weefsels op dia’s is een zeer gewilde techniek in veel wetenschappelijke gebieden. Echter, onderzoekers vaak handmatig tellen specimens of besteden aanzienlijke bedragen aan tijd aan het ontwikkelen van esoterische geautomatiseerde technieken om dit te bereiken. Hierin bieden we een protocol voor de geautomatiseerde dia scannen en kwantificatie van cellen met behulp van een WHCAS en de bijbehorende software, met aangeboren immuuncellen in bevroren menselijk brein tumor secties als voorbeeld. De bijbehorende software biedt een breed scala aan aanpasbare inbouwmodules van neurite uitgroei tellen tot differentiatie van cel typen1,2,3,4,5, 6. het doel van deze methode is om de onderzoekers te voorzien van een start-tot-einde, gemakkelijk reproduceerbaar protocol bij beelden van verwerven en kwantificeren van fluorescently-geëtiketteerden entiteiten in elke dia gemonteerde weefsels.
In dit protocol, wordt de WHCAS vooral gebruikt voor imaging-platen voor de daaropvolgende analyse van de bijbehorende software ook al een dia-adapter en de grondbeginselen aan dia scannen7 beschikbaar waren. Het was onbetaalbaar op afbeelding dia’s omdat de zorgvuldige ruimtelijke kalibratie van het gebied van acquisitie, de selectie van geschikte tijdschriften, het creëren van op maat gemaakte loadouts en een liaison met vertegenwoordigers van het product nodig waren. In de bredere lichaam van literatuur, in plaats van aankoop van een specifieke dia-imaging en analyse apparatuur8, heeft een vorige technologische verslag met toegang tot deze software de Beeldacquisitie van dia’s op de WHCAS in totaal9omzeild. Beeldanalyse verwerving of afbeelding uitvoeren op verschillende platformen vereist extra werk om ervoor te zorgen dat elk is compatibel met de andere.
De mogelijkheid om gebruik van de WHCAS en de bijbehorende software voor Fotolader zouden de geen onnodige complicaties van zoekt of ontwikkelen van een werkstroom vreemd deze hulpprogramma’s voorkomen. In dit artikel de stappen vereist om een lage vergroting overzicht scan en de bijbehorende hoge vergroting-afbeeldingen maken door de behandeling van de dia als een plaat, en de daaropvolgende analyses met behulp van de module segmentatie multi golflengte cel scoren toestaan voor de herbestemming van de WHCAS. Dit gemakkelijk bruikbaar protocol biedt een voordeel ten opzichte van alternatieve technieken, want er geen noodzaak is om algoritmen of meerdere stappen tellen protocollen10,11 , zodra de afbeeldingen zijn verworven op de WHCAS. Dit protocol vermindert de tijd die nodig is voor het optimaliseren van een kwantificatie techniek, is nauwkeuriger12 en efficiënter dan manuele tellen en maximaliseert het gebruik van de WHCAS. Dit protocol kan worden gemakkelijk en wijd gebruikt aangezien hierdoor de beeldvorming en de analyse van elke fluorescently-geëtiketteerden weefsels op dia’s.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een gemeenschappelijk probleem-nog steeds belemmeren de doeltreffendheid van de biologische wetenschap onderzoek is de ontwikkeling van protocollen voor de onpartijdige, nauwkeurige en precieze kwantificering van fluorescently-geëtiketteerden weefsels en hun structuren binnen. Significante hoeveelheid tijd en inspanning is gericht op het vinden van manieren om het analyseren van weefsel dia’s, zodra zij hebben al beeld. Veel bestaande methoden bieden algoritmen voor gebruikers opnieuw binnen programma’s12,13,14. Deze methoden zijn aanvaardbaar, maar de betekenis van dit verslag is dat het in staat de gebruiker stelt om gemakkelijk en snel een holistische Beeldacquisitie en analyse-protocol als de gebruiker toegang tot een WHCAS heeft. Testen die celtypes te differentiëren en kwantificeren van meerdere structuren en processen, celcyclus analyse en nucleaire translocatie, bijvoorbeeld, zijn reeds beschikbaar in de bijbehorende software.
De installatie bestaat uit een paar kritische stappen. Ten eerste, de ruimtelijke parameters van de dia worden gedefinieerd als ware het een plaat. Ten tweede wordt een lage vergroting overzicht scan gemaakt waaruit de regio’s van belang voor hoge vergroting imaging worden geselecteerd. Tot slot, sites die van invloed zijn op de nauwkeurigheid en precisie van latere analyses zijn uitgesloten. De grootste beperking van deze techniek is dat de toepasbaarheid ervan afhangt of de gebruiker toegang tot een WHCAS heeft. Echter, met de toenemende behoefte aan hoge-inhoudsanalyse systemen, veel instellingen verschaffen om hun onderzoekers te blijven concurrerend15. Probleemoplossing nodig is meestal wanneer weefselsecties niet dezelfde dikte hoeft. Als er meerdere regio’s van belang zijn geselecteerd, zullen sommigen in focus terwijl anderen niet zullen. Idealiter tijdens afdelen, zou de gebruiker verzorgen om te maken van homogene monsters. Echter, als de monsters zijn inconsistent, de focus op de nucleaire vlek golflengte (of de helderste fluorophore van de gebruiker), die wordt gebruikt om zich te concentreren, kunnen worden aangepast voor elke regio van de out-of-focus van belang en zelfs voor elke gezichtsveld. Zoals de andere golflengten gewoon verschoven ten van de golflengte van de nucleaire vlek opzichte zijn, moet alleen deze golflengte aanpassing.
In dit verslag, we in detail te beschrijven hoe om te scannen en analyseren van dia’s met behulp van een WHCAS en bijbehorende software. De multi golflengte cel scoren module kan de gebruiker automatisch tellen alle nucleaire of cytoplasmatische markeringen die fluorescently worden aangeduid. Na het instellen van de focus en bepaling van de cellulaire kenmerken zoals breedte en gebied voor het aanpassen van de module aan het weefsel beeld, is er geen verdere noodzaak voor de tussenkomst van de gebruiker om de verbeelde dia’s en kwantitatieve gegevens te verkrijgen. Maximaal drie dia’s tegelijk kan worden beeld en meerdere regio’s van belang kunnen worden gedefinieerd. Dit protocol laat WHCAS gebruikers die nodig hebben voor het analyseren van de dia’s profiteren van aanpasbare, multifunctionele, geautomatiseerde werkstromen die vereisen weinig tot geen optimalisatie en kunnen worden toegepast in alle projecten in de toekomst waarbij de histologische analyse van weefsel.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit project werd gefinancierd door een subsidie van de Canadese instituten van gezondheidsonderzoek en Alberta innoveert – Health oplossingen/Alberta kanker Foundation. De auteurs willen erkennen de regeneratie in neurobiologie kern faciliteit voor het gebruik van hun apparatuur, het werk van Paula Gedraitis in het gebouw van de stichting waarop dia scannen op de WHCAS werd mogelijk gemaakt, en de maker van de producten in dit artikel genoemde, moleculaire apparaten.
Materials
| ImageXpress MicroXLS | Molecular Devices | NA | Apparatus for image acquisition |
| MetaXpress 5.1 | Molecular Devices | NA | Associated software for ImageXpress MicroXL (runs on a PC with the Windows operating system). |
| Slide adapter | Molecular Devices | NA | Metal slide holder that fits into ImageXpress MicroXL |
| Slide_Region_Acquisition_revA.jzp | Molecular Devices | NA | The journal can be obtained from metamorph.moleculardevices.com/forum/showthread.php?tid=218&highlight=slide or from contacting a Molecular Devices representative |
| Slide_Region_Acquisition_Setup.JNL | Molecular Devices | NA | Select this journal in Step 6.6. |
References
- Hua, Y., Shun, T. Y., Strock, C. J., Johnston, P. A. High-content positional biosensor screening assay for compounds to prevent or disrupt androgen receptor and transcriptional intermediary factor 2 protein-protein interactions. Assay and Drug Development Technologies. 12 (7), 395-418 (2014).
- Rishal, I., et al. WIS-NeuroMath enables versatile high throughput analyses of neuronal processes. Developmental Neurobiology. 73 (3), 247-256 (2013).
- Kanungo, J., Lantz, S., Paule, M. G. In vivo imaging and quantitative analysis of changes in axon length using transgenic zebrafish embryos. Neurotoxicology and Teratology. 33 (6), 618-623 (2011).
- Schurmann, C., et al. Analyzing illumina gene expression microarray data from different tissues: methodological aspects of data analysis in the MetaXpress Consortium. PLoS ONE. 7 (12), e50938 (2012).
- Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. Journal of Visualized Experiments. (40), e1900 (2010).
- Bravo-San Pedro, J. M., et al. High-throughput quantification of GFP-LC3+ dots by automated fluorescence microscopy. Methods in Enzymology. , 71-86 (2017).
- Varga, V. S., et al. Automated multichannel fluorescent whole slide imaging and its application for cytometry. Cytometry Part A. 75 (12), 1020-1030 (2009).
- Narayan, P. J., et al. Assessing fibrinogen extravasation into Alzheimer’s disease brain using high-content screening of brain tissue microarrays. Journal of Neuroscience Methods. 247, 41-49 (2015).
- Du, Y., Budman, H. M., Duever, T. A. Segmentation and quantitative analysis of apoptosis of Chinese hamster ovary cells from fluorescence microscopy images. Microscopy and Microanalysis. 23 (3), 569-583 (2017).
- Mueller, J. L., et al. Quantitative segmentation of fluorescence microscopy images of heterogeneous tissue: application to the detection of residual disease in tumor margins. PLoS One. 8 (6), e66198 (2013).
- Donnelly, D. J., Gensel, J. C., Ankeny, D. P., van Rooijen, N., Popovich, P. G. An efficient and reproducible method for quantifying macrophages in different experimental models of central nervous system pathology. Journal of Neuroscience Methods. 181 (1), 36-44 (2009).
- Kozlowski, C., Weimer, R. M. An automated method to quantify microglia morphology and application to monitor activation state longitudinally in vivo. PLoS One. 7 (2), e31814 (2012).
- Fish, K. N., Sweet, R. A., Deo, A. J., Lewis, D. A. An automated segmentation methodology for quantifying immunoreactive puncta number and fluorescence intensity in tissue sections. Brain Research. 1240, 62-72 (2008).
- Zock, J. M. Applications of high content screening in life science research. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (9), 870-876 (2009).
