用 Widefield 高含量分析系统实现荧光标记组织的自动滑动扫描和分割

根据当地机构审查委员会和道德委员会批准的议定书获得肿瘤标本, 并按照国家条例进行。本文中使用的 WHCAS 及其相关软件列在材料表中。 1. 导入日志 打开关联的软件。 下载材料表中指示的日志套件。 单击主菜单标题日记本, 选择导入日记套件., 然后单击导入, 将日志套件导入适当的目录。 2. 创建预览扫描采集设置 在车牌采集设置对话框中, 转到目标和照相机选项卡. 选择4X 作为放大倍数, 1 作为照相机 binning, 并且2作为增益。 在板-Slidescanning下的图 1A中输入设置。注意: 已创建这些设置以允许用户查看和浏览多达3张幻灯片。每张幻灯片都分为3个相邻的井, 方便导航和 ‘ 活 ‘ 可视化的组织切片或细胞。 在要访问的站点选项卡中, 将井与站点统一填充。 单击编辑板底设置…并输入图 1B中显示的值。 在获取循环选项卡下, 为预览扫描输入所需的波长 (本例中的任何核污点)。为了得到最佳的对比度和基于图像的聚焦, 请使用最亮的荧光信号 (例如, 通常是核污点)。注意: 建议用明亮的污渍 (如核污点) 染色组织, 因为这提供了与背景相比的高对比度。这不仅有助于在样本位置, 但当成像多个荧光在下面的高放大率采集, 最明亮的颜色将用于基础上的其他颜色的成像偏移。 在 “板捕获” 模式下启用底纹校正, 将图像拼接在一起。 将这些设置保存为设置 A。 3. 在高放大率下创建幻灯片采集设置 在车牌采集设置对话框中, 转到目标和照相机选项卡. 选择40X 作为放大倍数, 1 作为照相机 binning (为最高的数字分辨率) 和2作为增益 (增加图像的信号和亮度)。注意: 可以使用较低的目标放大设置, 但作者发现40X 是使用多波长细胞评分模块分析脑肿瘤组织中人小胶质细胞和巨噬细胞的最佳设置。 确保板-Slidescanning和编辑板底设置的所有设置…选项卡与设置 A (请参见步骤 2) 相同。 如果获得的图像不脆, 请更改井深度、板高和板底部设置以调整焦点。如果焦点仍存在问题, 请在自动对焦选项部分中选择具有图像恢复的激光。 在获取循环选项卡下, 输入示例中存在的波长数。检查启用基于激光的聚焦和启用基于映像的聚焦 (用于获取或激光恢复)选项。 在自动对焦选项卡下, 选择将焦点放在 “板” 和 “底端”。 在日志选项卡中, 选择图 2中所示的选项, 确保防止异步硬件移动也被选中。 将这些设置保存为设置 B。 4. 将幻灯片放在 Widefield 高内容分析系统中 按F4以获取主菜单。选择幻灯片扫描。单击打开门–弹出幻灯片并插入幻灯片和幻灯片适配器 (可容纳多达三张幻灯片) 到 WHCAS (图 3A 和 3B)。将幻灯片定向到向下的盖玻片和幻灯片适配器中凹槽一侧的标签(图 3A)。注: 本实验中使用的幻灯片是标准的 25 x 75 x 1 mm 幻灯片。 单击关闭门–加载幻灯片。 5. 获取预览扫描 在筛选标题下, 选择车牌获取和控制…和车牌采集设置. 和加载设置 A。 在要访问的水井选项卡下, 使用鼠标上的右键单击按钮, 移动到包含该示例的井中。在要访问的站点选项卡下, 在单元格找到之前, 移动到具有Live图像捕获的不同站点。手动将焦点放在示例上或使用自动对焦。使用快照捕获图像。注意: 该示例更容易找到更多的站点, 并将站点调整到井 (参见步骤 2.3)。 在主菜单上, 选择预览幻灯片。 在自动弹出的对话框中, 选择反映要扫描多少张幻灯片的选项。一次扫描一张幻灯片。按确定。选择4X 作为放大倍数。按确定。选择盖玻片 (0.17毫米) 作为幻灯片方向 (如果使用不同的盖玻片粗细, 请使用更正衣领)。按确定。单击继续。注意: 如果用户希望获取2或更多幻灯片的预览扫描, 则必须在获取相应的高放大图像之前分别打开每个预览扫描。 在加载扫描幻灯片设置下, 确保选中购置设置和校准框。按取消。当扫描幻灯片设置框重新出现时, 选择继续。 出现扫描幻灯片对话框时, 根据图 4A-4C中的建议调整设置。完成后选择关闭。注: 增加相机的 binning 和减少相机曝光时间将导致更快的扫描, 虽然在较低的数字分辨率和动态范围, 从而降低图像质量。底纹校正将确保整个单一视野的均匀强度。打开硬件和图像自动对焦将确保扫描处于焦点, 但会减慢扫描速度。为了节省时间, 建议在获取低放大率扫描时有阴影校正和硬件和图像自动对焦, 但在高放大率成像期间为步骤6打开这些选项。低放大率扫描的分辨率不会影响高放大扫描的分辨率。 为幻灯片扫描数据选择一个目录。单击确定。输入文件的名称。单击确定。 绘图区域对话框将自动显示。使用矩形区域工具 (图 5A) 选择整个预览扫描区域, 如图 5B所示。单击继续。 将出现安装完成对话框。选择继续。注意: 预览幻灯片扫描现在将开始。 预览完成后, 将显示扫描完成对话框。选择继续。不要关闭预览扫描窗口 (在此示例中为DAPI 扫描窗口; 请参见图 6)。注: 安装和低放大扫描采集过程将需要大约20分钟。随后的高放大图像采集时间将取决于所选站点的数量以及每个通道的曝光时间。 6. 高放大率扫描 负载设置 B。 确定要成像的井。在要访问的水井选项卡下, 使用鼠标上的右键单击按钮, 移动到包含该示例的井中。注: 这项技术是在这里展示的成像井1。 在要访问的站点选项卡下, 使用Live功能移动到不同的站点, 直到单元格或组织位于该位置。手动将焦点放在示例上或使用自动对焦。使用快照捕获图像。注意: 为了帮助在高放大率下定位样本, 请使用 “车牌采集和控制” 对话框, 从5到100µm 调整步长大小, 以便在自动对焦不能的情况下查找样本。 在W1 DAPI选项卡下, 单击自动公开。确保车牌捕获快照 DAPI图像是脆的。 在主菜单下, 单击日记本以显示下拉。选择运行日志…。 双击幻灯片区域购置设置日志以启动它。当出现安装程序幻灯片区域捕获对话框时, 选择继续。 指示时, 正确选择DAPI 扫描以选择低放大率幻灯片图像。按确定。同样地, 当被要求进行车牌采集时, 请突出显示 “DAPI” 单元。单击确定。 当出现创建或加载区域框时, 使用矩形区域工具在 DAPI 扫描 (图 6) 上选择 (a) 感兴趣的区域。按继续。注意: 可在40X 中选择的最大区域为45列, 35 行。如果选择了多个感兴趣区域, 则区域将被调整为具有最大区域的框。可以在调整大小后重新定位这些框。 在加载区域对话框下选择否。注意: 选择是将以前保存的区域加载到与感兴趣位置相同区域的多个幻灯片上。 使用定位器工具, 突出显示感兴趣的最大区域, 然后在选择区域对话框下按继续。当出现确认区域框时, 选择继续。确定在出现保存区域对话框时是否需要保存区域。 下一个对话框站点间距允许用户选择平铺, 这会导致图像不重叠, 或者10% 重叠。选择一个选项, 然后单击确定。作者选择平铺。 三对话框将立即出现。安装完成框可以通过按继续来解除。保留 “40X” 的 “采集站点设置” 框 (图 7A) 现在打开, 因为它明确了需要在车牌采集设置框 (图 7B) 中输入多少列和行。保留显示在图像持续时间左下角的WellPositions框 (图 7C)。 在车牌采集设置框中, 在水井访问下, 必须突出显示以前选定的感兴趣区域的相同数量的水井 (图 7D)。注: 作者为每张幻灯片最多开发了九个感兴趣的区域。如果有更多, 只需增加 “板-SlideScanning ” 选项卡中的列或行数, 以反映感兴趣区域的数目。这些井不以任何方式在空间上代表感兴趣区域的位置, 但必须突出显示适当的数字 (左键单击)。 在车牌采集设置框中, 转到要访问的站点选项卡. 输入建议的列和行 (图 7B)。请记住单击平铺站点。 要消除查找包含该示例的站点的猜测, 请在摘要选项卡下按获取板, 将舞台放置在所选的感兴趣区域中。一旦摄像机在包含单元格的站点上平移, 请按下右下角的取消以停止图像获取。确保舞台现在位于样品上。 优化波长设置, 以确保获得聚焦和高动态范围图像。满意时, 单击摘要选项卡和获取板。 7. 图像分析 选择所需的自定义模块。注: 作者选择了多波长细胞评分模块来演示脑肿瘤切片的自动分割。 对所有站点运行分析。如果许多幻灯片的分析参数相同, 则可以将分析包括在 “后购置” 选项卡下的 “板购置设置” 框中。 完成分析后, 排除任何图像质量较差的站点, 以免对结果产生偏差。由于这一分析的目的是量化小胶质细胞和巨噬菌在肿瘤实质, 选择感兴趣的区域内的肿瘤标本的边缘。此外, 排除不聚焦的部位和/或包含组织褶皱或气泡和眼泪的组织。有关演示, 请参见代表结果。或者, 使用为每个站点生成的激光聚焦评分, 视激光反射的振幅为阈值, 以下是要排除的站点 (阈值是可自定义的, 取决于参数, 如曝光时间和使用的媒体类型)。注: 高放大图像可以明确排除结构, 如大血管和坏死区, 如有必要。也有可能只包括感兴趣的领域, 如那些 hypercellular。这种方法可以提高分析的特异性和准确性。