RNA プルダウン長い非コード RNA の RNA 標的を識別する手順

いくつかの最近の調査示した lncRNAs がほぼすべての重要な生物学的プロセスに重要な役割を果たすこと、この役割は、転写、転写後のレベルで両方で発生する遺伝子発現の制御が行われますRna lncRNAs6の標的となる可能性を後者の場合を示します。 LncRNA 核濃縮豊富な転写 1 (Neat1)、異なる neuropathologies で前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、またはてんかん8,9,10として関与している、misregulated はまたさまざまな癌11,12。 この lncRNA は、特定の原子力機関、paraspeckles の構造のコンポーネントと遺伝子式13の転写後の概日リズム調節に関与するにも知られています。すべての細胞の核内にある、いくつかの RNA 結合タンパク質 (RBP)14、周りだけでなく、それらの形成に必要な Neat1 だけでなく周りに形成が Paraspeckles が15 核内 RNA ターゲットを保持することができる確かに知られています。.Paraspeckles の形成は、さまざまなコンポーネントの協会によって実現されます。この形成は、RNA ターゲット13のリズミカルな核保有を運転概日リズム パターンを表示する示されました。RBP へのバインディングを介して、または直接 RNA/協会を通じて、paraspeckles による RNA ターゲットの核の保持が発生するが、rna paraspeckles の対象となる範囲を決定する持っていた。直接ターゲットに RNA を識別するためにまたは直接 Neat1、によって RNA のプルダウンのプロトコル設計されましたいない分離や組織サンプル (グラフィックの図 1を参照してくださいのように培養細胞と同様にすべての Neat1 RNA 標的の同定ができます。技術のプレゼンテーション)。 プロトコルは、別の lncRNA 転移関連付けられた肺腺癌成績証明書 1 (Malat1) の RNA 標的の同定にも正常に適用されました。Malat1 は、一緒にいくつかの RNA スプライシング因子核スペックルが見つかりました非常に節約され、表現された lncRNA です。Malat1 は、いくつかの初期の mRNA16,17のスプライシングの調節に関与すると知られています。 特定 (SO) と非特異的オリゴヌクレオチド (NSO) プローブは、ここで説明されているプローブの設計方法を使用して生成されました。この戦略は、lncRNA の二次構造の予測として内部塩基対の低確率を表示する領域の選択、これらの地域の強い親和性を持つ特定のプローブの設計に依存します。これらのバイオインフォマティクスの予測、Neat1 の一連の二次構造予測の写真の代表的な結果として (1,480 に 2,000 のヌクレオチド) プローブは、図 2で与えられるように設計されています 2 つの位置と共に。 設計されたプローブは、Neat1 または Malat1 をラット培養 GH4C1 細胞とマウス Neat1 下垂体組織のエキス (表 1) のために指示されました。入力のサンプルに対する非特異的, 特異プローブの相対的な強化の Neat1 または Malat1 を計算しました。図 3は、GH4C1 下垂体細胞株 (図 3 a) ラット プル ダウン Neat1 特定のプローブの効率とマウス下垂体組織を抽出 (図 3 b)。生成する特定のオリゴヌクレオチド (ので) Malat1 宛てにプローブ プローブ設計プロトコルを使用して (図 4 a) 十分に効率的ではなかった別の中、効率的なプローブが得られた 1 つ破棄されます。 RNA の後 GH4C1 抽出物の Neat1 または Malat1 に関連付けられる Rt-qpcr 実験、特異的プライマー (表 1) を評価いくつかの Rna によって続いてプル ダウン手順を示した。GH4C1 細胞抽出液の Neat1 に関連付けられている Rna も下垂体抽出液について Neat1 に関連する示されていた。確かに、Neat1 RNA プルダウン後 Malat1 は GH4C1 細胞株、マウスの下垂体組織抽出物 (図 5 a) 両方 Neat1 で対象とする発見されました。相互、Neat1 は豊か Malat1 RNA プルダウンの GH4C1 細胞 (図 4 b) 特定のプローブを実行後の大幅になりました。これらの結果が Neat1 と Neat1 RNA 発現18,のバリエーションを表示 Malat1 ノックアウト マウスによって提案された Malat1 の潜在的なコンテンツ共同規制役割と一致している 2 つの lncRNAs の密接な関係を強調することによって19. 主な 2 つの下垂体ホルモン、プロラクチン (Prl) (図 5) と成長ホルモン (Gh) (図 5 b) の成績証明書が GH4C1 細胞、下垂体特定のプローブ Neat1 RNA プルダウン後濃縮大幅抽出物、Neat1 によって 2 つのホルモン性制御の可能性を示唆しています。使用される 2 つの特定のプローブを比較すると、それは RNA ターゲットと見なされます (図 5 bおよび図 5) によってその効率が変わるという点登場しました。これらの結果は、その RNA ターゲットの濃縮でプルダウン ・ lncRNA の濃縮で最高効率だけでなく、最高レベルの効率性を表示するものを選択するためにいくつかの特定のプローブを設計の必要性を強調します。 利益13の lncRNA の RNA ターゲットの包括的なリストを取得する RNA 高スループット シーケンスによって RNA プルダウン法がわかります。上記 2 つの特定のプローブを用いた Neat1 RNA プルダウンを実行した後、GH4C1 下垂体細胞の RNA シーケンス解析。NSO と RNA プルダウンが図書館の建設を許可するのに十分な RNA のレベルが回復された場合、NSO を用いた負の制御も RNA シーケンス解析にさらされることが注意する必要があります。これは以前経験13の場合ではなかった。トップハット/カフリンクスを使用して特定のプローブの使用を行った後に生成されたライブラリ パイプライン20及び成績につきプラスミドあたりフラグメントの値だけ万マップリード (FPKM) 1 は考慮したよりも高い。Neat1 に 2 つの特定のプローブで得られたリスト (表 1) 結果の特異性を評価するために交差しました。4,268 遺伝子は、paraspeckles、GH4C1 セル13で表現された成績証明書の 28% を占めているに関連付けられていました。QPCR 分析 (図 5 a C) を使用して得られた結果と一致して、Gh、Prl と Malat1 の成績は、Neat1 に関連する発見されました。RNA プルダウン法は、lncRNAs とその RNA ターゲット間の相互作用を探検する効率的なツールであること従って証明されています。 図 1: RNA のグラフィカルな表現を下ろす手順です。最初の日に細胞や組織されたパラホルムアルデヒドをクロスリンクした溶解し,、ビオチン化特定プローブを追加することによって行われた交配手順の前に超音波処理します。細胞ライセートの残りの部分から別の特定の材料に磁気ストレプトアビジン ビーズを追加されました。2 日目、ビーズは磁石によって分離され数回洗浄され。・ デ ・架橋ステップには、精製と Rt-qpcr または RNA シーケンス解析に使用された Rna の回復が許可され。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 2: 二次構造バイオインフォマティクス リソース (RNAstructure ウェブサーバ; 最低の自由エネルギー構造) によって予測された Neat1 シーケンス (ヌクレオチド 1,480 に 2,000).構造は基本ペアの確率のある程度に従って色の。2 つのオリゴヌクレオチド プローブ (SO1 と SO2) 赤では、Neat1 RNA の構造に沿って配置されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 3: 入力対 Neat1 濃縮の qPCR 検証します。Neat1 RNA 後入力対 Neat1 濃縮の qPCR の検証は、2 つ異なる特定のプローブ (GH4C1 細胞と SO1 mm SO2 rn SO1 rn および下垂体組織の SO2 mm) に比べて非特異的でプルダウン (GH4C1 細胞の NSO-rn と NSO mm 1 つ下垂体組織) (B) GH4C1 ラット細胞 (A) とマウス下垂体組織を抽出します。結果は、3 に 10 の実験で得られた平均 ± SEM です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 4: Malat1 RNA 後入力対 Malat1、Neat1 濃縮の qPCR 検証がプルダウンします。Malat1 の qPCR の検証 (A) と Neat1 後 Malat1 RNA 入力対 (B) の濃縮を 2 つ異なる特定のプローブ (SO3-rn と SO4-rn) に比べて非特異的でプルダウン 1 つ (NSO rn) GH4C1 ラット細胞で。結果は、3 の実験で得られた平均 ± SEM です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 5: Malat1、Gh、Prl 濃縮 Neat1 RNA をプルダウンした後、入力対の qPCR 検証します。Malat1 の qPCR の検証 (A)、Gh (B) Neat1 RNA 後入力対 Prl (C) 濃縮プルダウンして GH4C1 ラット細胞における非特定の 1 つと比較すると異なる特定のプローブを使用し、マウス下垂体組織を抽出します。結果は、3 に 8 実験で得られた平均 ± SEM です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 プローブ名 シーケンス NSO Rn TAAAATACCATTTGATGTTTGAAATTAT SO1 Rn CTCCACCATCATCAATCCTCTGGAC SO2-Rn GCCTTCCCACATTTAAAAACACAAC SO3-Rn AACTCGTGGCTCAAGTGAGGTGACA SO4-Rn AAGACTCTCAGGCTCCTGCTCATTC NSO mm GTTTGTGGTTTAACAGTGGGAAGGC SO1 mm GCCTTCCCACTGTTAAACCACAAAC SO2 mm CTCACCCGCACCCCGACTCCTTCAA qPCR プライマー: ドブネズミ Neat1 AAGGCACGAGTTAGCCGCAAAT TGTGCACAGTCAGACCTGTCATTC Malat1 GAAGGCGTGTACTGCTATGCTGTT TCTCCTGAGGTGACTGTGAACCAA Gh1 CCGCGTCTATGAGAAACTGAAGGA GGTTTGCTTGAGGATCTGCCCAAT Prl TGAACCTGATCCTCAGTTTGGT AGCTGCTTGTTTTGTTCCTCAA ハツカネズミ Neat1 TGGGCCCTGGGTCATCTTACTAGATA CACAGCTGTTCCAATGAGCGATCT Gh1 CTCGGACCGTGTCTATGAGAAACTGA TTTGCTTGAGGATCTGCCCAACAC Prl TGAACCTGATCCTCAGTTTGGT AGCTGCTTGTTTTGTTCCTCAA 表 1: シーケンスの DNA オリゴヌクレオチド プローブと qPCR プライマー