Uzun kodlamayan RNA, RNA hedefleri tanımlamak için RNA Pull-down yordamı
Summary
Bu RNA açılan yöntem uzun kodlamayan RNA (lncRNA) RNA hedeflerini belirleme sağlar. Ev yapımı, tasarlanmış Anti-anlamda DNA Oligonükleotid probları bu lncRNA uygun bir şekilde sabit doku veya hücre için belirli hibridizasyon dayanarak, verimli bir şekilde lncRNA ait tüm RNA hedefleri yakalama sağlar.
Abstract
Uzun bir tanımlanmış okuma çerçeve olmadan 200’den fazla nükleotit dizilerinin olan RNA (lncRNA), kodlamayan düzenleyici kodlamayan RNA’ın ailesine ait. Her ne kadar biyolojik işlevleri büyük ölçüde bilinmeyen kalır, bu lncRNAs sayısı giderek artmıştır ve bu şimdi insanlar 10.000’den fazla tür transkript olabilir tahmin edilmektedir. Bunlardan bazıları transkripsiyon düzeyi, fakat aynı zamanda RNA co – ve çoğu olgunlaşma farklı adımları gerçekleşecek önemli yasal yollar gen ifadesinin yer olduğu bilinmektedir. İkinci durumda, tespit edilmesi lncRNA tarafından hedef RNA’ların var. Bu neden kimlik RNA’ların doğrudan ilişkili olan ya da dolaylı olarak bir lncRNA ilgi ile sağlayan bir yöntem geliştirmek yararlıdır nedenidir.
Bir lncRNA ile birlikte, ilişkili Kromatin dizileri izolasyon sağlar daha önce yayımlanmış iletişim kuralları tarafından ilham kaynağı oldu, bu iletişim kuralını ilişkili RNA’ların yalıtım izin vermek için uyarlanmıştır. Biz iki adım bu protokolünün etkinliği için kritik belirlenir. İlk belirli DNA Anti-anlamda Oligonükleotid probları faiz lncRNA için melezlemek mümkün tasarımıdır. Bu amaçla, lncRNA ikincil yapı Biyoinformatik tarafından tahmin edilmiştir ve anti-anlamda Oligonükleotid probları iç baz eşleşmesi düşük bir olasılık görüntülemek bölgeler için güçlü bir yakınlık ile tasarlanmıştır. İkinci önemli adım yordam doku veya tüm moleküler ortakları arasında ağ korumak için olan kültürlü hücreleri sabitleştirici koşulları kullanır. Yüksek işlem hacmi RNA sıralama ile birleştiğinde, bu RNA açılan iletişim kuralı bir lncRNA ilgi tüm RNA interactome sağlayabilir.
Introduction
Burada açıklanan yöntemi genel amacı uzun kodlamayan RNA (lncRNA) RNA moleküler ortakları belirlemektir. LncRNA tanımlanmış okuma çerçeve olmadan 200’den fazla nükleotit dizilerinin karşılık gelir. Bazıları gen ifade düzenlemesi, transkripsiyon düzeyinde, hem de RNA co – ve çoğu olgunlaşma farklı adımlar dahil olmak için göstermiştir. İkinci durumda, moleküler lncRNA, belirlenecek olan RNA’ların ortağız. RNA’ların doğrudan ilişkili olan ya da dolaylı olarak bir lncRNA ilgi ile kimlik etkinleştirme yöntemi daha sonra geliştirmek için gerekli olacaktır.
Kromatin yalıtım RNA arıtma (cıvıltı)1,2 ve yakalama hibridizasyon analizi, RNA hedefler (grafik)3,4, tarafından izin yüksek üretilen iş keşfi olarak daha önce yayınlanan yöntemleri, RNA bağlı proteinler ve genomik bağlama sitelerin belirli bir lncRNA. Bu iki yöntem, faiz lncRNA ilk biotinylated tamamlayıcı oligonucleotides melezleşmiştir ve karmaşık sonra streptavidin boncuklar kullanılarak izole. Bu iki teknik arasındaki temel fark lncRNAs hedef probları için tasarım ilgilidir. Cıvıltı, strateji RNA balık tarafından lncRNA tüm uzunluğu döşemek için kısa Tamamlayıcı DNA Oligonükleotid probları bir havuz tasarımı oluşuyordu, ilham. Buna karşılık, GRAFİKTE, site hibridizasyon için mevcut soruşturma için lncRNAs bir RNase H eşleme tahlil yazarlar uyarlanmış.
Burada önerilen tasarım Anti-anlamda DNA biotinylated Oligonükleotid iç düşük bir olasılık görüntülemek bölgeler için güçlü bir yakınlık ile seçmek için lncRNA ikincil yapı5 / Biyoinformatik modelleme probları probları kullanır yordamı baz çifti. Bu yordam döşeme Oligonükleotid probları2 takımlık üzerinde dayalı olanlar daha ucuz ve daha az zaman alıcı RNAse H duyarlılık4üzerinde dayalı olanlar daha olmanın avantajı vardır.
Kanıt lncRNAs6tarafından çoğu gen düzenlemesi için büyüyen bir vücut gibi bir lncRNA hedefler RNA’ların yakalama etkinleştirme bir yaklaşım geliştirmek çok yararlıdır. Ayrıca, çoğu uygulama için kullanılabilir olması için yaklaşım hem kültürlü hücre ve doku özleri optimize edildi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Büyük bir alan araştırma uzun kodlamayan RNA’ların (lncRNAs) sayısı ve çeşitliliği temsil ve rolleri hala keşfedilmeyi çoğu. Çoğu bu lncRNAs nükleer bir Yerelleştirme ve bunlar arasında bazı transkripsiyon veya posttranscriptional mekanizmalar yoluyla gen ifadesinin yasal yollar karıştığı. Bu alanda geçerli sorunlardan biri bu lncRNAs RNA’ların çoğu işlemedeki alaka anlamaktır. Bu amaçla, lncRNAs tarafından hedef RNA’ların tespit edilmesi gerekiyor. Önceki çalışmalarda lncRNAs Derneği Kromatin ile üzerinde duruldu esinlenerek, RNA’ların bir lncRNA ile ilişkili kimliği sağlar bir yordam geliştirdik. Esas olarak iki önemli adım üzerinde bağımlı RNA aşağı açılır adlı bu protokol başarıdır, yani Anti-anlamda DNA Oligonükleotid probları tasarımını var özellikle ve sadece ilgi lncRNA ve doku koşullarına melezlemek veya Tüm moleküler ortakları arasında ağ bütünlüğünü korumak zorunda hücre fiksasyon.
Daha önce bir lncRNA ile birlikte, ilişkili Kromatin dizileri (cıvıltı1,2, grafik3,4) yalıtmak için yordamları sağlanan protokoller yayınlandı. Bu protokoller farklı stratejiler Anti-anlamda DNA biotinylated Oligonükleotid probları tasarım istihdam edildi. Cıvıltı yordamda yazarlar DNA biotinylated Oligonükleotid probları lncRNA ilgi tüm uzunluğu tüm gereksiz ve non-spesifik problar1,2dışlanması sonra kapsayan bir havuz kullanılır. GRAFİK protokolündeki yazarlar hibridizasyon için daha erişilebilir lncRNA bölgelerinde tespit ve bu bölgelerde hedef yakalama oligonucleotides tasarlanmış. Bu bölgeler temelinde kendi RNase H duyarlılık seçildi. Gerçekten de, RNA’ların RNA-DNA bağlama sitelerdeki hidrolize için RNAse H özelliğini kullanarak, lncRNA erişilebilir sitelere melezlemek oligonucleotides RNA-DNA melez üretmek ve lncRNA enzimatik bölünme için yol. Yazarlar bu aday yakalama oligonucleotides üçü seçili ve onları bir kokteyl3,4‘ te kullanılan.
Yordamı grafik protokolünde kullanılan anti-anlamda DNA biotinylated Oligonükleotid probları yapıldı yakın tasarım yapardık ama istenen lncRNA hibridizasyon kullanılabilir bölgelerinde onların RNAse H duyarlılık temelinde, seçili değil ama Biyoinformatik modelleme lncRNA ikincil yapılara sahip tarafından belirlenen iç baz eşleşmesi onların düşük olasılık göre. Farklı ikincil yapılar farklı algoritmaları kullanarak tahmin ve seçilecek sondalar o lncRNA en büyük sayısı tahmin ikincil yapılar olarak kullanılabilir sıralarını melezlemek olmalıdır fark gerekir. Aynı sonuçları üç tasarlanmış bir kokteyl, belirli probları veya tek bir sonda kullanarak tek tek elde edilmiştir. Bu iki ayrı, belirli problar kullanımı ve bu iki problar için ortak olan bu olumlu sonuçlar dikkate istenir. Son olarak, bu nedenle bir en iyi sonuç için yöntem geliştirilmesi başında önerilir ve 3 farklı Anti-anlamda Oligonükleotid tasarlamak için aşağı açılır, sonuçlarını özgüllük değerlendirmek muktedir probları ve sonra karşılaştırmak için özellikle sonda verimliliği hücre lysate hazırlık tarafından değişmiş olabilir beri deneysel olarak onların verimliliği. Yine de, lncRNA biz kullanılan yapısı daha ucuz fayans Oligonükleotid probları2takımlık üzerinde temel kaldı ve bu yöntemi göre daha az zaman alıcı ikincil modellenmesi Biyoinformatik dayalı soruşturma tasarım prosedürü RNAse H duyarlılık4üzerinde.
Bir negatif kontrol negatif yakalama Oligonükleotid anlamda DNA biotinylated Oligonükleotid probları gibi kullanarak aynı zamanda gerçekleştirilmesi gereken veya Oligonükleotid probları veya karşı ilgisiz bir RNA yönetmen oligonucleotides karıştırılmış. Doğal antianlamlı transkript lncRNAs varlığı nedeniyle anlamda Oligonükleotid sonda kullanımı bazen yetersiz olabilir. Negatif denetim için seçilmiş Oligonükleotid sonda ne olursa olsun, bilinen bir RNA ile melez değil patlamanın kontrol etmek ve bu Oligonükleotid hala un ek açıklama eklenen bir lncRNA melezlemek akılda tutmak için gereklidir.
Bu RNA açılan deneylerde kullanılan hücre lysates 10 elde edilmiştir6 -107 hücreler kültürlü hücrelerle ve 1-10 mg doku ile çalışırken çalışırken. Hücre lysates hazırlanması optimize edilmiş olması gereken iki ana adımları ile kullanılan doku veya hücre tipine göre adapte gerekiyor: Yani, cross-linking adım lncRNA ve moleküler ortakları arasında Kovalent bağlar oluşumunu sağlayan ve viskozite Kromatin parçalama tarafından azaltır sonication adım.
Cross-linking adım tüm moleküler ortakları arasında bir ağ oluşumu inducing tarafından tüm RNA hedefler için lncRNA kapalı kalmasını sağlamak için amaçtır. Yararlanılabilmesi için retiküle. lncRNA ve ortakları arasında Kovalent bağlar oluşturacak bir paraformaldehyde tedavi adım sağlar GRAFİK iletişim kuralında nükleer lncRNA ile paraformaldehyde ile ilk tedavi gerçekleştirmek için çalışan bütün lysate hücre ve bir saniye önerildi tedavi izole nükleik kesir3,4. Hücrelerdeki lncRNA erişilebilirlik azaltarak, bu ek adım sondalar, verimliliğini muhtemelen azalma gözlendi. Bu nedenle, hücre dikkate alarak adapte olmak paraformaldehyde tarafından Şebekeleşme derecesine sahiptir veya doku türü kullanıldığında, yerelleştirme tasarlanmış probları etkinlik ve faiz lncRNA.
Hücreleri lysing, süre Kromatin lysate içinde yayınlanır ve viskozite artırır; Kromatin örnekleri akışkanlık ve dolayısıyla Oligonükleotid erişilebilirliğini kolaylaştırmak için sonication tarafından parçalamak için gerekli faiz lncRNA için probları, sonra nedir. Ancak, sonication da faiz lncRNA ile çıkarılan RNA’ları parçalayıp. Böyle bir şekilde verimli bir şekilde lysate viskozite azaltır iken, bu da bir uzunluğu ile elde RNA’ın parçaları sağlayan sonication süresini en aza indirmek önemli 200-800 bp. sonication zaman-ecek var olmak yüksek not arasında oluşan, sonra nedir hem miktar hem de doku veya kullanılan kültürlü hücre türüne bağlıdır.
Sonuç olarak, burada açıklanan yordam 2-3 gün içinde istenen lncRNA RNA hedeflerini yakalama sağlar. RT-qPCR ile birleştiğinde, bu yöntemler tarafından istenen lncRNA bir aday yaklaşım olarak bir ilişki ve düzenleme, bir mRNA arıyor izin verir. Genom geniş yaklaşım için RNA açılan deneyler yüksek üretilen iş RNA-sıralama istenen lncRNA ile ilişkili tüm RNA’ların alınmasını sağlayan tarafından analiz edilebilir. Seçilen her türlü analitik strateji, RNA açılan yordam tarafından lncRNAs RNA regülasyonu yeni önemli bilgi sağlamalıdır.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Aix-Marseille Üniversitesi ve CNRS tarafından desteklenen ve Pfizer laboratuvarlar bir hibe tarafından finanse.
Materials
| Bioruptor Plus | Diagenode | B01020001 | Sonicator |
| Dynabeads My One | Thermo-Fisher | 65001 | Magnetic streptavidin beads |
| Formamide | Thermo-Fisher | 15515-026 | |
| Gel electrophoresis apparatus | Advance | Mupid-One | Gel electrophoresis apparatus |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| RNA XS purification kit | Macherey-Nagel | 740902 | RNA purificationkit |
| RNAseOUT | Thermo-Fisher | 10777-019 | RNAse inhibitor |
| Trizol | Thermo-Fisher | 15596018 | RNA purification |
| Tube Rotator | Stuart | SB2 | Eppendorf tube rotator |
| RNA to DNA | Thermo-Fisher | 4387405 | Reverse transcription kit |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725124 | qPCR reagent |
| Applied 7500 Fast | Thermo-Fisher | 4351107 | qPCR apparatus |
| Illumina TruSeq Stranded mRNA Sample Preparation kit | Illumina | 20020594 | DNA library construction kit |
| Illumina NextSeq 500 | Illumina | SY-415-1002 | NGS system |
References
- Chu, C., Qu, K., Zhong, F. L., Artandi, S. E., Chang, H. Y. Genomic maps of long noncoding RNA occupancy reveal principles of RNA-chromatin interactions. Mol Cell. , 667-678 (2011).
- Chu, C., Quinn, J., Chang, H. Y. Chromatin isolation by RNA purification (ChIRP). J Vis Exp. , e3912 (2012).
- Simon, M. D., Wang, C. I., Kharchenko, P. V., West, J. A., Chapman, B. A., Alekseyenko, A. A., Borowsky, M. L., Kuroda, M. I., Kingston, R. E. The genomic binding sites of a noncoding RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. , 20497-20502 (2011).
- Simon, M. D. Capture hybridization analysis of RNA targets (CHART). Curr Protoc Mol Biol. , (2013).
- Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).
- Sun, X., Haider Ali, M. S. S., Moran, M. The role of interactions of long non-coding RNAs and heterogeneous nuclear ribonucleoproteins in regulating cellular functions. Biochem J. , 2925-2935 (2017).
- Gruber, A. R., Lorenz, R., Bernhart, S. H., Neuböck, R., Hofacker, I. L. The Vienna RNA websuite. Nucleic Acids Res. , W70-W74 (2008).
- Tollervey, J. R., Curk, T., Rogelj, B., Briese, M., Cereda, M., Kayikci, M., König, J., Hortobágyi, T., Nishimura, A. L., Zupunski, V., Patani, R., Chandran, S., Rot, G., Zupan, B., Shaw, C. E., Ule, J. Characterizing the RNA targets and position-dependent splicing regulation by TDP-43. Nat Neurosci. , 452-458 (2011).
- Riva, P., Ratti, A., Venturin, M. The long non-coding RNAs in neurodegenerative diseases: novel mechanisms of pathogenesis. Curr Alzheimer Res. (27338628), (2016).
- Barry, G., Briggs, J. A., Hwang, D. W., Nayler, S. P., Fortuna, P. R., Jonkhout, N., Dachet, F., Maag, J. L., Mestdagh, P., Singh, E. M., Avesson, L., Kaczorowski, D. C., Ozturk, E., Jones, N. C., Vetter, I., Arriola-Martinez, L., Hu, J., Franco, G. R., Warn, V. M., Gong, A., Dinger, M. E., Rigo, F., Lipovich, L., Morris, M. J., O’Brien, T. J., Lee, D. S., Loeb, J. A., Blackshaw, S., Mattick, J. S., Wolvetang, E. J. The long non-coding RNA NEAT1 is responsive to neuronal activity and is associated with hyperexcitability states. Sci Rep. , 40127 (2017).
- Adriaens, C., Standaert, L., Barra, J., Latil, M., Verfaillie, A., Kalev, P., Boeckx, B., Wijnhoven, P. W., Radaelli, E., Vermi, W., Leucci, E., Lapouge, G., Beck, B., van den Oord, J., Nakagawa, S., Hirose, T., Sablina, A. A., Lambrechts, D., Aerts, S., Blanpain, C., Marine, J. C. p53 induces formation of NEAT1 lncRNA-containing paraspeckles that modulate replication stress response and chemosensitivity. Nat Med. , (2016).
- Fang, J., Qiao, F., Tu, J., Xu, J., Ding, F., Liu, Y., Akuo, B. A., Hu, J., Shao, S. High expression of long non-coding RNA NEAT1 indicates poor prognosis of human cancer. Oncotarget. , (2017).
- Torres, M., Becquet, D., Blanchard, M. P., Guillen, S., Boyer, B., Moreno, M., Franc, J. L., François-Bellan, A. M. Circadian RNA expression elicited by 3′-UTR IRAlu-paraspeckle associated elements. Elife. , (2016).
- Chen, L. L., DeCerbo, J. N., Carmichael, G. G. Alu element-mediated gene silencing. EMBO J. , 1694-1705 (2008).
- Tripathi, V., Ellis, J. D., Shen, Z., Song, D. Y., Pan, Q., Watt, A. T., Freier, S. M., Bennett, C. F., Sharma, A., Bubulya, P. A., Blencowe, B. J., Prasanth, S. G., Prasanth, K. V. The nuclear-retained noncoding RNA MALAT1 regulates alternative splicing by modulating SR splicing factor phosphorylation. Mol Cell. , 925-938 (2010).
- Engreitz, J. M., Sirokman, K., McDonel, P., Shishkin, A. A., Surka, C., Russell, P., Grossman, S. R., Chow, A. Y., Guttman, M., Lander, E. S. RNA-RNA Interactions Enable Specific Targeting of Noncoding RNAs to Nascent Pre-mRNAs and Chromatin Sites. Cell. , 188-199 (2014).
- Nakagawa, S., Ip, J. Y., Shioi, G., Tripathi, V., Zong, X., Hirose, T., Prasanth, K. V. Malat1 is not an essential component of nuclear speckles in mice. RNA. , (2012).
- Zhang, B., Arun, G., Mao, Y. S., Lazar, Z., Hung, G., Bhattacharjee, G., Xiao, X., Booth, C. J., Wu, J., Zhang, C., Spector, D. L. The lncRNA Malat1 is dispensable for mouse development but its transcription plays a cis-regulatory role in the adult. Cell Rep. , 111-123 (2012).
- Trapnell, C., Roberts, A., Goff, L., Pertea, G., Kim, D., Kelley, D. R., Pimentel, H., Salzberg, S. L., Rinn, J. L., Pachter, L. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. , 562-578 (2012).
