Bouw van synthetische Phage weergegeven Fab bibliotheek met op maat gemaakte diversiteit

mAbs heeft brede toepassingen variërend van fundamenteel onderzoek tot de diagnose van de ziekte en therapeutics. Vanaf 2016 zijn meer dan 60 mAbs goedgekeurd door de Amerikaanse Food and Drug Administration (USFDA) voor de klinische behandeling van auto-immuunziekten, kanker en infectieziekten^1,2.

In 1975 rapporteerde Kohler en Milstein een techniek voor de continue generatie van antilichamen van een enkele klonen specificiteit van een cellulaire bron aangeduid als ‘hybridomas’ en deze techniek is later uitgegroeid tot een hoeksteen in geneeskunde en industrie^{3 ,4}. Generatie van mAbs door deze methode vereist een paar stappen, met inbegrip van de productie van antigeen muis immunisatie, winning van B-lymfocyten, fusie van B-cellen met myeloma cellen vormen onsterfelijke hybridoma cellen, selectie van de kloon, en voor therapeutische toepassingen, humanisering is vereist om te voorkomen dat menselijke anti-muis-antilichamen (HAMA)^4,5. Echter, voor deze technologie, antigenen met inbegrip van toxines, pathogenen en zeer geconserveerde eiwitten zijn relatief niet effectief in het genereren van een immuunrespons in vivo voor mAb productie⁵.

In 1978 gemeld Hutchison et al. het gebruik van een oligonucleotide aan directe mutagenese van een residu in een single-stranded bacteriofaag virus⁶. In 1985, Smith gemeld dat buitenlandse gene fragmenten kunnen worden gesmolten in het frame met het gen codering faag vacht eiwit III en kunnen dus worden weergegeven op het oppervlak van de bacteriofaag zonder afbreuk te doen aan haar infectiviteit⁷. Deze baanbrekende werken een basis gelegd voor de latere aanleg van phage-weergegeven antilichaam bibliotheken in immuun, naïef, en synthetische vormt met de formaten van single-keten variabele fragment (scFv) en antigeen-bindende fragment (Fab) voor therapeutische mAb development^8,9. Van de technisch oogpunt, de ontwikkeling van het antilichaam weergave gebaseerde van de bacteriofaag biedt een complementaire benadering van hybridoma gebaseerde mAb ontwikkeling dat bijdragen kan tot het omzeilen van de beperkingen die sommige antigenen kunnen opleveren en de humanisering proces dat hybridoma afkomstige antilichamen vereisen vaak⁵. Vanaf 2016, 6 faag display afkomstige mAbs zijn goedgekeurd in de markt met inbegrip van Humira, een van de meest succesvolle mAbs gebruikt voor de behandeling van reumatoïde artritis, en vele faag display afkomstige antilichaam kandidaten zijn momenteel in diverse stadia van klinische onderzoek¹⁰.

Voor immuun- en naïef faag antilichaam bibliotheken, de diversiteit van complementariteit-bepalen regio’s (CDR) in lichte en zware keten is afgeleid van het natuurlijke immuunsysteem repertoire (d.w.z., van B-cellen). De diversiteit van CDR in synthetische faag antilichaam bibliotheken is daarentegen volledig kunstmatige. Synthetische benaderingen van bibliotheek bouw bieden nauwkeurige controle over het ontwerp van de reeks diversiteit en bieden mogelijkheden voor mechanistische studies van antilichaam structuur en werken^11,12. Bovendien kan het kader voor synthetische bibliotheken worden geoptimaliseerd voor bibliotheek bouw om stroomafwaarts, grootschalige industriële ontwikkeling^11,12.

In 1985, Kunkel rapporteerde een single-stranded DNA (ssDNA) mutagenese sjabloon gebaseerde benadering om plaats-geleide mutaties in M13 bacteriofaag efficiënt¹³. Deze aanpak werd vervolgens op grote schaal gebruikt voor de bouw van bibliotheken faag-weergegeven. Chemisch gesynthetiseerd DNA oligonucleotides ontworpen om diversiteit in Fab CDR worden opgenomen in een phagemid met een antilichaam ruggengraat sjabloon. In dit proces, de phagemid wordt uitgedrukt als een uracil-bevattende ssDNA (dU-ssDNA) en de oligonucleotides worden gegloeid op de CDR en verruimd en double-stranded DNA (dsDNA) in aanwezigheid van DNA van T7 polymerase en T4 DNA ligase synthetiseren. Tot slot kan gegenereerde ds-DNA in Escherichia coli door electroporation worden binnengebracht.

Voor hoge diversiteit, faag-weergegeven bibliotheek bouw, hoog-voltage electroporation van een tweecomponenten mengsel van electro-bevoegde cellen en covalent moet gesloten circulaire dsDNA (CCC-dsDNA) zorgvuldig worden voorbereid. Sidhu et al. bewerkt voor de bereiding van electro-bevoegde cellen en DNA op basis van traditionele methoden en sterk verbeterde bibliotheek diversiteit¹⁴.

In dit protocol beschrijven we een methode voor de bouw van synthetische faag-weergegeven Fab bibliotheken met diversiteit van 10⁹-10¹⁰ verkrijgbaar met een enkel electroporation. Figuur 1 toont een overzicht van de bibliotheek bouw waaronder: 1) hoogrendabele electro-bevoegde cel voorbereiding; 2) extractie van dU-ssDNA; 3) Kunkel methode gebaseerd oligonucleotide gerichte mutagenese; 4) electroporation en berekening van de grootte van de bibliotheek; 5) eiwit A/L gebaseerde ELISA voor het vouwen en functionele diversiteit evaluatie; en 6) DNA sequentieanalyse van diversiteit. In de materiaal tabelstaan alle reagentia, stammen en apparatuur. Tabel 1 toont de reagens setup.