Отслеживание дрозофилы личиночной поведение в ответ на Optogenetic стимуляции обонятельных нейронов
Summary
Этот протокол анализирует навигационных поведение дрозофилы личинка в ответ на одновременное optogenetic стимуляции обонятельных нейронов. Свет 630 Нм длины волны используется для активации отдельных обонятельных нейронов, выражая родопсин смещается красный канал. Личинок движение одновременно отслеживается, цифровой записали и анализируются с помощью пользовательской программы.
Abstract
Насекомых способность перемещаться к запах источников основывается на деятельности их первого порядка обонятельных рецепторов нейронов (ORNs). Хотя значительный объем информации был создан относительно Орн ответы для отдушки, роль конкретных ORNs в автошколах поведенческих реакций по-прежнему осознаются. Осложнения при анализе поведения возникают из-за различных неустойчивого характера отдушки, активировать отдельные ORNs, несколько ORNs, активированную одного отдушки и трудности в репликации естественно наблюдаемых временной вариации в обонятельные стимулы с помощью методы в обычных запах доставки в лаборатории. Здесь мы описываем протокол, который анализирует дрозофилы личиночной поведение в ответ на стимуляцию одновременное optogenetic его ORNs. Optogenetic технология, используемая здесь позволяет специфики Орн активации и точный контроль временных моделей активации Орн. Соответствующее движение личинок отслеживается, цифровой записали и анализируются с помощью пользовательских письменного программного обеспечения. Заменив запах раздражителей с легкими раздражители, этот метод позволяет для более точного управления отдельных Орн активации с целью изучения ее влияния на личиночной поведение. Наш метод может быть продлен для изучения воздействия второго порядка проекции нейронов (ПНС) а также местные нейронов (LNs) на личиночной поведение. Таким образом, этот метод позволит всеобъемлющий рассечение обонятельных цепи функции и дополнять исследования как обонятельных нейронов деятельности перевести в поведение ответов.
Introduction
Обонятельной информации в среде larva дрозофилы воспринимается только 21 функционально различных ORNs, деятельность которого в конечном итоге определяют поведение личинок1,2,3,4. Тем не менее относительно мало известно о логике, в которой сенсорная информация кодируется в деятельности этих 21 ORNs. Таким образом, существует необходимость экспериментально определить функциональный вклад каждой личиночной Орн поведение.
Хотя сенсорные ответ профиль весь репертуар дрозофилы личинок ORNs изучалось в деталях1,4,5, вклад отдельных ORNs контуре обонятельных и тем самым навигационных поведение по-прежнему во многом неизвестным. До настоящего времени, возникают трудности в личиночной поведение исследования, из-за неспособности пространственно и временно активировать одного ORNs. Группа отдушки, который специально активировать 19 21 дрозофилы личинок ORNs был недавно описан1. Каждый одоранта в панели, при низких концентрациях, вызывает физиологический ответ только от его родственных Орн. Однако при более высоких концентрациях, которые обычно используются для обычных поведение анализов, каждый одоранта вызывает физиологические реакции от нескольких ORNs1,5,6. Кроме того отдушки в этой панели менялись нестабильности, которые усложняют интерпретации поведения исследований, которые зависят от формирования стабильных запах градиенты7,8. Наконец естественно происходя запах стимулы имеют временной компонент, который трудно воспроизвести в лабораторных условиях. Поэтому важно разработать метод, который можно измерить личиночной поведение при одновременно активации отдельных ORNs образом пространственных и временных.
Здесь мы демонстрируем, что метод, который имеет преимущества по сравнению с ранее описанных личиночной отслеживания assays1,8. Assay отслеживания, описанных в Gershow et al. использует электронно управляемые клапаны для поддержания стабильной градиент запаха в поведение Арена8. Однако из-за уровня комплексный инжиниринг участвует построить установки стимул запах, этот метод является трудно воспроизвести в других лабораториях. Кроме того остаются нерешенными вопросы, связанные с использованием отдушки специально активировать одного ORNs. Assay отслеживания, описанные в Мэтью et al. использует простую систему доставки запах, но результирующий градиент запаха зависит от волатильности тест одоранта и неустойчива для длительного времени пробирного1. Таким образом заменив запах раздражителей с легкими раздражители, наш метод имеет преимущества специфичности и точный временной контроль Орн активации и не зависит от формирования запах градиентов различные сильные.
Наш метод прост в настройке и подходит для исследователей, заинтересованных в измерении аспекты дрозофилы личиночной навигации. Эта техника могут быть адаптированы к другим системам модель, условии, что исследователь имеет возможность управлять выражение CsChrimson в neuron(s) свои любимые системы выбора. CsChrimson версия перешел красного канала родопсина. Он активируется на длинах волн, которые являются невидимыми для личинок Фототаксис системы. Поэтому мы можем манипулировать активность нейронов с9специфика, надежность и воспроизводимость. Путем изменения пользовательских письменного программного обеспечения для учета изменения размера субъектов, этот метод может быть легко адаптирована для обхода личинки других видов насекомых.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описал метод, который позволяет для измерения дрозофилы личиночной поведения в ответ на одновременное optogenetic активации обонятельных нейронов. Ранее описанный личиночной отслеживания методы1,8 использовать технологии доставки различных за…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддерживается путем запуска средства от Университет Невады в Рено, NIGMS национального института здравоохранения под номер гранта P20 GM103650.
Materials
| Video camera to capture larval movement | |||
| CCD Camera | Edmund Optics | 106215 | |
| M52 to M55 Filter Thread Adapter | Edmund Optics | 59-446 | |
| 2" Square Threaded Filter Holder for Imaging Lenses | Edmund Optics | 59-445 | |
| RG-715, 2" Sq. Longpass Filter | Edmund Optics | 46-066 | |
| Electronics for optogenetic setup | |||
| Raspberry Pi 2B | RASPBERRY-PI.org | RPI2-MODB-V1.2 | |
| 3 Channel programmable power supply | newegg.com | 9SIA3C62037092 | |
| 8 Channel optocoupler relay | amazon.com | 6454319 | |
| 630nm Quad-row LED strip lights | environmentallights.com | red3528-450-reel | |
| 850nm LED strips | environmentallights.com | wp-4000K-CC5050-60×2-kit | |
| Software | |||
| Matlab | Mathworks Inc. | ||
| Ubuntu MATE v16.04 | Nubuntu | https://github.com/yslo/nubuntu | |
| Other items | |||
| Plexiglass black acrylic | Home Depot | MC1184848bl | |
| Fly food and other reagents | |||
| Nutrifly fly food | Genesee Scientific | 66-112 | |
| Agarose powder | Genesee Scientific | 20-102 | |
| 22cm X 22cm square petri-dish | VWR Inc. | 25382-327 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| All trans-retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | |
| Flies | |||
| UAS-IVS-CsChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55134 | |
| Orco-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 26818 | |
| Or42a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 9970 | |
| Or7a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 23907 |
References
- Mathew, D., et al. Functional diversity among sensory receptors in a Drosophila olfactory circuit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2134-2143 (2013).
- Ramaekers, A., et al. Glomerular maps without cellular redundancy at successive levels of the Drosophila larval olfactory circuit. Current biology : CB. 15, 982-992 (2005).
- Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. Molecular, anatomical, and functional organization of the Drosophila olfactory system. Current biology : CB. 15, 1535-1547 (2005).
- Kreher, S. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila larva. Neuron. 46, 445-456 (2005).
- Kreher, S. A., Mathew, D., Kim, J., Carlson, J. R. Translation of sensory input into behavioral output via an olfactory system. Neuron. 59, 110-124 (2008).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125, 143-160 (2006).
- Monte, P., et al. Characterization of the larval olfactory response in Drosophila and its genetic basis. Behav Genet. 19, 267-283 (1989).
- Gershow, M., et al. Controlling airborne cues to study small animal navigation. Nature methods. 9, 290-296 (2012).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11, 338-346 (2014).
- Hernandez-Nunez, L., et al. Reverse-correlation analysis of navigation dynamics in Drosophila larva using optogenetics. eLife. 4, (2015).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature methods. 10, 64-67 (2013).
- Newquist, G., Novenschi, A., Kohler, D., Mathew, D. Differential contributions of Olfactory Receptor Neurons in a Drosophila olfactory circuit. eNeuro. 3, (2016).
- Schulze, A., et al. Dynamical feature extraction at the sensory periphery guides chemotaxis. eLife. 4, (2015).
- Tastekin, I., et al. Role of the Subesophageal Zone in Sensorimotor Control of Orientation in Drosophila Larva. Current Biology. 25, 1448-1460 (2015).
- Famiglietti, E. V., Kolb, H. Structural basis for ON-and OFF-center responses in retinal ganglion cells. Science. 194, 193-195 (1976).
- Luo, L., et al. Bidirectional thermotaxis in Caenorhabditis elegans is mediated by distinct sensorimotor strategies driven by the AFD thermosensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2776-2781 (2014).
- Berck, M. E., et al. The wiring diagram of a glomerular olfactory system. eLife. 5, (2016).
