تتبع السلوك المورفولوجية اليرقات في الاستجابة للتحفيز أوبتوجينيتيك الخلايا العصبية حاسة الشم
Summary
ويحلل هذا البروتوكول السلوك الملاحية ليرقة المورفولوجية استجابة للتحفيز أوبتوجينيتيك المتزامنة في الخلايا العصبية حاسة الشم. ضوء الطول الموجي نانومتر 630 يستخدم لتنشيط الخلايا العصبية حاسة الشم الفردية معربا عن رودوبسين قناة إزاحة الأحمر. تنقل اليرقات يتم تعقبها في نفس الوقت، سجلت رقمياً، وتحليلها باستخدام برنامج مخصص مكتوب.
Abstract
وتستند قدرة الحشرات على الانتقال نحو مصادر رائحة أنشطة تلك الخلايا العصبية مستقبلات الشم الدرجة الأولى (أورنس). بينما تم إنشاؤها قدرا كبيرا من المعلومات فيما يتعلق بالردود اورن إلى أودورانتس، يظل دور ORNs محددة في قيادة الاستجابات السلوكية غير مفهومة. تنشأ مضاعفات في تحليل السلوك بسبب التقلبات المختلفة من أودورانتس أن تنشيط الفردية أورنس، أورنس متعددة تنشيط أودورانتس واحد، والصعوبة في تكرار الملاحظة بطبيعة الحال التغيرات الزمنية في حاسة الشم المحفزات استخدام طرق الإيصال رائحة التقليدية في المختبر. هنا، يمكننا وصف بروتوكول الذي يحلل السلوك المورفولوجية اليرقات في الاستجابة للتحفيز أوبتوجينيتيك المتزامن لما أورنس. أوبتوجينيتيك التكنولوجيا المستخدمة هنا يسمح لخصوصية اورن التنشيط ومراقبة دقيقة للأنماط الزمانية للتنشيط اورن. يتم تعقب حركة اليرقات المقابلة والمسجلة رقمياً وتحليلها باستخدام مخصص كتابة البرمجيات. باستبدال المحفزات رائحة بالمنبهات الخفيفة، يسمح هذا الأسلوب لعنصر تحكم أكثر دقة من فرادى اورن التنشيط من أجل دراسة تأثيرها على سلوك اليرقات. ويمكن تمديد أسلوبنا كذلك دراسة أثر إسقاط الدرجة الثانية من الخلايا العصبية (السندات الإذنية) فضلا عن الخلايا العصبية المحلية (لنس) في سلوك اليرقات. وبالتالي سيمكن هذا الأسلوب تشريح شاملة لوظيفة دائرة حاسة الشم وتكملة الدراسات المتعلقة بحاسة الشم كيف العصبية أنشطة ترجمة في إلى استجابات السلوك.
Introduction
هو لمست حاسة الشم من المعلومات في بيئة المورفولوجية ليرقة قبل 21 فقط ORNs المتميزة وظيفيا، الأنشطة التي تحدد في نهاية المطاف سلوك اليرقات1،2،،من34. ومع ذلك، المعروف قليل نسبيا عن المنطق الذي يتم ترميز المعلومات الحسية في أنشطة هذه أورنس 21. ومن ثم هناك حاجة تجريبيا قياس المساهمات الفنية لكل اورن اليرقات للسلوك.
ورغم أن درست الشخصية الاستجابة الحسية المورفولوجية اليرقات ORNs مرجع كامل في التفصيل1،4،5، المساهمات المقدمة أورنس الفردية على حلبة حاسة الشم وبالتالي السلوك الملاحية لا تزال مجهولة إلى حد كبير. تنشأ صعوبات في دراسات سلوك اليرقات، حتى الآن، بسبب عدم القدرة على تنشيط مكانياً وزمنياً أورنس واحد. وكان فريق أودورانتس التي تنشط على وجه التحديد 19 21 المورفولوجية اليرقات ORNs مؤخرا وصف1. كل الرائحة في الفريق، في تركيزات منخفضة، يتسبب استجابة فسيولوجية فقط من اورن المشابهة لها. ومع ذلك، يتسبب كل الرائحة في تركيزات أعلى التي تستخدم عادة لفحوصات السلوك التقليدية، الاستجابات الفسيولوجية من عدة أورنس1،،من56. علاوة على ذلك، فقد تنوعت odorants في هذا الفريق التقلبات أن تعقيد التفسير لدراسات السلوك التي تعتمد على تشكيل من رائحة مستقرة التدرجات7،8. أخيرا، وبطبيعة الحال قد تحدث رائحة المحفزات مكون الزمانية التي من الصعب تكرار الظروف المختبرية. ولذلك من المهم وضع طريقة التي يمكن قياس سلوك اليرقات أثناء تنشيط ORNs الفردية في نفس الوقت بطريقة المكانية والزمانية.
هنا، علينا أن نظهر فحوصات أسلوب يحتوي على مزايا أكثر من تعقب اليرقات هو موضح سابقا1،8. والرزن تتبع الموصوفة في جيرشوو et al. تستخدم صمامات التحكم الإلكتروني للمحافظة على تدرج مستقرة من رائحة في الساحة السلوك8. ومع ذلك، نظراً لمستوى الهندسية المعقدة المعنية لبناء برنامج الإعداد التحفيز رائحة، هذا الأسلوب صعبة للنسخ المتماثل في مختبرات أخرى. علاوة على ذلك، لم تحسم المسائل المتصلة باستخدام أودورانتس لتنشيط أورنس واحد على وجه التحديد. مقايسة تتبع الموصوفة في ماثيو et al. يستخدم نظام إيصال رائحة أبسط، ولكن التدرج رائحة الناتجة تعتمد على التقلب في اختبار الرائحة وغير مستقرة لفترات طويلة من الفحص1. وهكذا، باستبدال المحفزات رائحة بالمنبهات الخفيفة، لدينا أسلوب مزايا خصوصية ودقة السيطرة الزمنية لتفعيل اورن ولا تعتمد على تشكيل من رائحة التدرجات من مختلف نقاط القوة.
لدينا طريقة سهلة لإعداد والمناسبة للباحثين المهتمين في قياس جوانب الملاحة المورفولوجية اليرقات. هذا الأسلوب يمكن تكييفه للنظم النموذجية الأخرى شريطة أن يكون قادراً على التعبير عن كشريمسون في neuron(s) نظامهم المفضل لاختيار محرك الباحث. كشريمسون صيغة تحول الأحمر من رهودوبسن القناة. يتم تنشيطه عند أطوال موجية التي غير مرئية لنظام فوتوتاكسيس لليرقة. ولذلك نحن قادرة على التلاعب بنشاط الخلايا العصبية مع خصوصية، والموثوقية، وإمكانية تكرار نتائج9. عن طريق تعديل مخصص كتابة البرامج لحساب حجم التغييرات من الموضوعات، هذا الأسلوب يمكن بسهولة تكييف لزحف اليرقات من أنواع الحشرات الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، يمكننا وصف أسلوب يسمح لقياس سلوك اليرقات المورفولوجية استجابة للتنشيط أوبتوجينيتيك المتزامنة من الخلايا العصبية حاسة الشم. سبق وصف اليرقات تتبع أساليب1،8 استخدام تكنولوجيا التسليم رائحة مختلفة لتنشيط أورنس. ومع ذلك، يتعذر التحكم هذه الأساليب لخ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل بأموال بدء التشغيل من جامعة نيفادا، رينو، والتي نيجمس من “المعهد الوطني للصحة” تحت رقم المنحة P20 GM103650.
Materials
| Video camera to capture larval movement | |||
| CCD Camera | Edmund Optics | 106215 | |
| M52 to M55 Filter Thread Adapter | Edmund Optics | 59-446 | |
| 2" Square Threaded Filter Holder for Imaging Lenses | Edmund Optics | 59-445 | |
| RG-715, 2" Sq. Longpass Filter | Edmund Optics | 46-066 | |
| Electronics for optogenetic setup | |||
| Raspberry Pi 2B | RASPBERRY-PI.org | RPI2-MODB-V1.2 | |
| 3 Channel programmable power supply | newegg.com | 9SIA3C62037092 | |
| 8 Channel optocoupler relay | amazon.com | 6454319 | |
| 630nm Quad-row LED strip lights | environmentallights.com | red3528-450-reel | |
| 850nm LED strips | environmentallights.com | wp-4000K-CC5050-60×2-kit | |
| Software | |||
| Matlab | Mathworks Inc. | ||
| Ubuntu MATE v16.04 | Nubuntu | https://github.com/yslo/nubuntu | |
| Other items | |||
| Plexiglass black acrylic | Home Depot | MC1184848bl | |
| Fly food and other reagents | |||
| Nutrifly fly food | Genesee Scientific | 66-112 | |
| Agarose powder | Genesee Scientific | 20-102 | |
| 22cm X 22cm square petri-dish | VWR Inc. | 25382-327 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| All trans-retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | |
| Flies | |||
| UAS-IVS-CsChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55134 | |
| Orco-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 26818 | |
| Or42a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 9970 | |
| Or7a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 23907 |
References
- Mathew, D., et al. Functional diversity among sensory receptors in a Drosophila olfactory circuit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2134-2143 (2013).
- Ramaekers, A., et al. Glomerular maps without cellular redundancy at successive levels of the Drosophila larval olfactory circuit. Current biology : CB. 15, 982-992 (2005).
- Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. Molecular, anatomical, and functional organization of the Drosophila olfactory system. Current biology : CB. 15, 1535-1547 (2005).
- Kreher, S. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila larva. Neuron. 46, 445-456 (2005).
- Kreher, S. A., Mathew, D., Kim, J., Carlson, J. R. Translation of sensory input into behavioral output via an olfactory system. Neuron. 59, 110-124 (2008).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125, 143-160 (2006).
- Monte, P., et al. Characterization of the larval olfactory response in Drosophila and its genetic basis. Behav Genet. 19, 267-283 (1989).
- Gershow, M., et al. Controlling airborne cues to study small animal navigation. Nature methods. 9, 290-296 (2012).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11, 338-346 (2014).
- Hernandez-Nunez, L., et al. Reverse-correlation analysis of navigation dynamics in Drosophila larva using optogenetics. eLife. 4, (2015).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature methods. 10, 64-67 (2013).
- Newquist, G., Novenschi, A., Kohler, D., Mathew, D. Differential contributions of Olfactory Receptor Neurons in a Drosophila olfactory circuit. eNeuro. 3, (2016).
- Schulze, A., et al. Dynamical feature extraction at the sensory periphery guides chemotaxis. eLife. 4, (2015).
- Tastekin, I., et al. Role of the Subesophageal Zone in Sensorimotor Control of Orientation in Drosophila Larva. Current Biology. 25, 1448-1460 (2015).
- Famiglietti, E. V., Kolb, H. Structural basis for ON-and OFF-center responses in retinal ganglion cells. Science. 194, 193-195 (1976).
- Luo, L., et al. Bidirectional thermotaxis in Caenorhabditis elegans is mediated by distinct sensorimotor strategies driven by the AFD thermosensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2776-2781 (2014).
- Berck, M. E., et al. The wiring diagram of a glomerular olfactory system. eLife. 5, (2016).
