新鮮な人間の脳から脳の毛細血管の分離

血液脳関門は、血液と何が入るし、脳から出てくるを決定する脳の間厳重に管理されたインターフェイスです。解剖学的, 血管内皮細胞は血液脳関門を作成し、複雑で、連続的な毛細血管網を形成します。生理、この毛細血管網は同時に炭酸ガスや代謝の廃棄物を処分しながら脳に酸素と栄養素を供給します。重要なは、証拠は、バリアへの変更が多数の病理学、アルツハイマー病、てんかん、脳卒中^1,2,3,4,5などに貢献することをサポートしています^,6,7. 脳血管内皮細胞はまた、例えば脳に薬剤の吸収をブロックすることによって治療にバリアとして役立つ、膠腫瘍切除術^8,9,を次の化学療法^。10. 分離脳毛細血管がバリア特性生体内でバリア機能と健康障害の研究では、これとよく似たユニークな体外血液脳関門モデルを表現するこの点では、疾患。この記事では、一貫して高品質の毛細血管で人間の脳から脳の毛細血管を分離し、血液脳関門の研究をもたらすのためのプロトコルを提供します。

1969 年に Siakotosら。¹¹は、脳の毛細血管密度勾配遠心分離とガラス ビーズ列分離を用いたウシと人間の脳組織からの分離を報告する最初でした。その後、ゴールドスタインら¹²は、脳毛細血管グルコース輸送の代謝活性を維持しながら、ラットから分離された研究に必要な組織の量を削減する複数の濾過手順を追加することによってこの方法を改善しました。その後、研究者は何度もキャピラリー分離手順を最適化し、各イテレーション^13,14,15法と脳毛細血管モデルを改善します。たとえば、Pardridgeら。¹⁶機械の均質化ではなく、酵素消化を使用して牛の毛細血管を分離し、210 μ m のメッシュ フィルターとガラス ビーズの列を介して毛細血管の懸濁液をその後渡されます。これらの変更は、分離脳毛細血管のトリパン ブルー色素排除汚れを改善し、したがって、内皮細胞生存率を増加します。1990 年代初頭にダレールら。¹⁷は、γ – グルタミルトランスフェラーゼ (γ-GTase) およびアルカリホスファターゼの代謝活性を維持され神経汚染の明確なウシおよびラットの毛細血管を分離しました。2000 年、ミラーら。¹⁸毛細血管の内腔に輸送基質の蓄積を共焦点顕微鏡との組み合わせでラットとブタ脳毛細血管を使用しました。その後、当研究室は、脳毛細血管分離手順を最適化するために続けているし、P-糖タンパク質 (P gp)^19,20,21, 乳癌を決定する輸送アッセイを設けて抵抗蛋白質 (BCRP)^22,23日、多剤耐性蛋白質 2 (Mrp2)²⁴交通活動。2004 年、我々 は様々 なシグナル伝達経路を調査するラット脳毛細血管を用いて 2 つのレポートを公開しました。ハルツら。²¹、そのペプチドのエンドセリン 1 急速かつ可逆的減少 P gp トランスポート機能 (PKC) エンドセリン受容体 B (エ_B) 受容体、一酸化窒素合成酵素 (NOS) および蛋白質キナーゼ C を介して作用することにより脳の毛細血管でわかりました。バウアーらで¹⁹、我々 は核内受容体有する X レセプター (PXR) の発現と脳の毛細血管で P gp 式とトランスポート機能の示した PXR 変調を実証しました。遺伝子組換えヒト PXR マウスでの実験、研究のこのラインを拡大し、体内バリアにより骨折 P gp hPXR 活性化²⁵まで引き締めを示した。2010 年にハルツら。²⁶ P gp タンパク質発現を復元し、トランスポート ノザン ハップ トランスジェニック人間アミロイド前駆体タンパク質 (ハップ) マウスの動作このアプローチを使用します。また、ハップの P gp を復元するマウス大幅削減アミロイド β (a β)₄₀と a β₄₂の脳レベル。

シグナル伝達経路を検討するほか、分離脳の毛細血管は毛細血管漏出として参照する毛細血管の透過性の変更を確認する使用できます。特に、テキサス赤の漏出試金は、時間とこれらのデータで毛細血管の内腔からテキサス赤は漏洩率を分析に使用し、蛍光色素の漏出を評価するために使用されます。コントロールの毛細血管からのそれらと比較して増加した毛細血管漏出率は、血液-脳関門²の物理的な整合性の変化を示します。バリア、例えばに関連付けられている多くの病気の状態があるので、これは貴重な、てんかん、多発性硬化症、アルツハイマー病、外傷性脳傷害^{27,28,29、。 30}です。他のグループはまた蛋白質の表現、蛋白質^31,32,33,34,^{の輸送活性を調節するシグナル伝達経路を識別する孤立した毛細血管を利用します。 35,36,37}。最後に、人間の脳の毛細血管を分離するためこのメソッドを最適化してまいりましたし、最近、我々 はてんかん発作のない制御個人^{38 に比べて患者におけるひと血液脳関門で P gp 発現の増加を示した}.一緒に取られて、これらの開発は、分離脳の毛細血管がバリア機能を勉強する汎用的なモデルとして使用できることを示します。

様々 な体外体内、および体外血液脳関門モデルの基礎研究および産業創薬スクリーニング、脳^39,報^{40,41 への薬物送達をテストの目的で主に使用されています。 ,42,43,44}。脳毛細血管分離前のヴィヴォに加えてには現在血液脳関門モデル、インシリコモデル、分離脳毛細血管内皮細胞の様々 な由来不死化細胞株の in vitro細胞培養種の培養脳内毛細血管内皮細胞とマイクロ流体チップのモデルに区別するひと多能性幹細胞 (hPSC) の文化。

インシリコモデルは、予測吸収、分布、代謝、排泄 (ADME) プロパティに基づく新薬候補を選択するため医薬品開発で最も一般的に使用されます。定量的構造物性相関 (QSPR) モデルなど量的な構造活動関係 (QSAR) モデル メソッドは、脳浸透薬剤の候補者を予測するライブラリの高スループット スクリーニングで使用される人気のあるメソッド^45,46. これらのモデルは、バリア貫通性の分子を画面に便利。

ベッツら⁴⁷は、体外血液脳関門モデル システムとしての培養脳内毛細血管内皮細胞の単分子膜を設立しました。人間の脳微小血管内皮細胞 (hCMECs) など新鮮な組織や不死化血管内皮細胞を用いて細胞文化モデルの in vitro脳浸透または機構研究のための別の高スループット スクリーニング ツールをすることができます。ただし、脳毛細血管内皮細胞培養モデル毛細血管の内腔内の血流の生理学的な剪断応力がない、全体的な生物学的複雑さに限られている、重要なバリア成分の発現や局在の変化を受けタイト結合タンパク質など表面の受容器、トランスポーター、酵素、イオン チャンネルは^48,49,50。逆に、内皮細胞膜に由来する hPSCs hCMEC/D3 の文化と比較して低糖透磁率がある、いくつかの血液脳関門輸送、接着分子、タイトな接合^51,の偏光式が含まれて⁵²です。 しかし、これらの細胞も文化でのプロパティの変更は、体内バリアのプロパティ⁵²・のシステムを検証する必要があります。

血液脳関門の研究の新しい動向、マイクロ流体デバイスを生成する臓器・ オン ・ チップ技術を使用してまたは中空繊維技術^53,を利用した人工の毛細血管を作成する 3 D 培養システムを利用^54,55。 人工の毛細血管、脳毛細血管 (3-7 μ m) よりも大幅に大きい直径 (100-200 μ m) があります。したがって、せん断力、体外で完全に似ていない体内状況。これは、”blood-brain-barrier-on-a-chip”マイクロ流体デバイス、マイクロ流体せん断力を生成するこれらのデバイスを人工膜フォームの「血」と「脳」のコンパートメントと流体を励起しているに扱われます。同様に、アストロ サイトのさまざまな組み合わせで血管内皮細胞や血管平滑筋細胞の共培養もで使用されている中空繊維技術体内条件⁵⁶下の粘弾性パラメーターを再作成するには^,57,58です。 ただし、わかりにくい方法もこのモデルは血液脳関門輸送、代謝、シグナル伝達、などなどの他のプロパティを反映します。これらの人工毛細血管とチップのモデルは薬の高スループット スクリーニングに適したが、文化の中に、これらのモデルを生成するために使用するセルが予告なく変更も。

冷凍と固定脳スライスまたは原発性脳毛細血管内皮細胞の文化は人間の血管を研究^5,59,60,61に使用することができます追加のモデル。たとえば、固定脳組織の免疫組織化学を使用して蛋白質のローカリゼーションを決定、健康式は病気にかかったティッシュと比較します。

組織スライスとの in vitroモデルに加えて上記、新鮮な分離脳の毛細血管は血液脳関門の機能を研究する利用できます。この孤立した毛細血管モデルの制限新鮮な人間の脳組織を取得する難しさを含んで比較的時間のかかる分離プロセスと神経細胞、アストロ サイトの不在。分離脳毛細血管モデルの利点は、このモデル体内状況を密接に似ているし、したがって、バリア機能不全の評価に使用できます。重要なは、試金および分子生物学手法^3,19,,6263の多数を使用してシグナルを見分けることも使用することができます。

加齢に関するサンダース ブラウン センターを介して両方の生鮮、冷凍人間の脳組織へのアクセス研究室 (IRB #B15-2602-M)⁶⁴。このコンテキストで解剖標準プロトコルに従う、脳には求め < 4 h、およびすべての手順は NIH ラット ベスト プラクティスのガイドライン⁶⁵に適合。人間の脳組織へのこのユニークなアクセスを与えを設置し、そのまま、実行可能な人間の脳の毛細血管の高収率の結果人間の脳から脳の毛細血管を分離するためのプロトコルを最適化します。関心の 2 つの一般的なエンドポイントは、タンパク質の発現と活性を決定します。この点で、我々 と他の蛋白質の表現および活動レベルを勉強する分離脳の毛細血管で使える様々 なアッセイを設けてください。これらのアッセイは、西部にしみが付くこと、シンプルなウエスタン アッセイ、酵素免疫測定法 (ELISA)、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR)、量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR)、ザイモグラフィー、輸送活動のアッセイと毛細血管漏出試金。これらの試できる研究者が人間の病理学的条件でバリア機能の変化を研究、蛋白質の表現や活動を支配する経路を決定する、関連付けられている血液脳関門の治療のための薬理学的ターゲットを特定するには病気。

一緒に、新鮮な分離脳の毛細血管は血液-脳関門の堅牢かつ再現可能なモデルとして利用できます。特に、このモデルは、さまざまなバリア機能を勉強するエンドポイントを決定する多くの異なるアッセイと組み合わせることができます。