Isolatie van cerebrale haarvaten van verse menselijk hersenweefsel

De bloed – hersen-barrière is een strak gecontroleerde interface tussen het bloed en de hersenen die bepaalt wat er in en uit de hersenen komt. Anatomisch, endotheliale cellen componeren van de bloed – hersenbarrière en vormt een complexe, voortdurende capillaire netwerk. Fysiologisch, levert dit capillaire netwerk de hersenen met zuurstof en voedingsstoffen terwijl tegelijkertijd verwijdering van kooldioxide en afvalstoffen stofwisselingsproducten. Nog belangrijker is, ondersteunt bewijs dat de wijzigingen in de barrière aan vele ziekten bijdragen, waaronder de ziekte van Alzheimer, epilepsie en beroerte^{1,2,3,4,5 , 6 , 7}. hersenen endotheliale cellen ook als een belemmering voor de behandeling dienen door het blokkeren van opname van de drug in de hersenen, bv., chemotherapie van glioblastoma multiforme na tumor resectie^{8,9, 10}. In dit verband geïsoleerde menselijke hersenen haarvaten vertegenwoordigen een unieke ex vivo bloed – hersenbarrière model dat sterk lijkt op barrière eigenschappen in vivo, die het mogelijk voor de studie van de barrièrefunctie en dysfunctie in gezondheid maakt en ziekte. In dit artikel geven wij een protocol om te isoleren van de haarvaten van de hersenen van menselijke hersenen op een constant hoog capillaire kwaliteit en opbrengst om te bestuderen van de bloed – hersenbarrière.

In 1969, Siakotos et al. ¹¹ waren de eersten die het verslag van het isolement van de haarvaten van de hersenen van runderen en menselijk hersenweefsel met behulp van dichtheid kleurovergang centrifugeren en glazen kraal kolom scheiding. Later, Goldstein et al. Deze methode verbeterd ¹² door het toevoegen van meerdere filtratie stappen om te verminderen van de hoeveelheid weefsel te bestuderen van de haarvaten van de hersenen van ratten, geïsoleerd met behoud van de metabole activiteit van glucose vervoer nodig. Sindsdien onderzoekers geoptimaliseerd de capillaire isolatie procedure talloze malen, verbetering van de methode en de hersenen capillaire model met elke iteratie^13,14,15. Bijvoorbeeld, Pardridge et al. ¹⁶ boviene haarvaten met behulp van enzymatische spijsvertering in plaats van mechanische homogenisering geïsoleerd, en dan vervolgens doorgegeven een capillaire schorsing door een 210 µm mesh filter en een glazen kraal kolom. Deze wijzigingen de trypan blauwe uitsluiting vlek van geïsoleerde hersenen haarvaten verbeterd en dus verhoogd endothelial cel levensvatbaarheid. In de vroege jaren 1990, Dallaire et al. ¹⁷ geïsoleerd runderen en rat haarvaten, die waren duidelijk van neuronale besmetting en onderhouden metabole activiteit of alkalische fosfatase en Gamma-glutamyl transferase (γ-GTase). In 2000, Miller et al. ¹⁸, gebruikt geïsoleerde rat en varkens hersenen haarvaten in combinatie met confocale microscopie te tonen van de accumulatie van vervoer substraten in het lumen van de haarvaten. Vervolgens ons laboratorium doorgegaan met het optimaliseren van de hersenen capillaire isolatie procedure en wij hebben vastgesteld dat vervoer testen om te bepalen van P-glycoproteïne (P-gp)^19,20,21, borstkanker weerstand eiwit (BCRP)^22,23, en meerdere drugweerstand eiwit 2 (Mrp2)²⁴ vervoersactiviteit. In 2004 publiceerden we twee verslagen waar we gewend geïsoleerde rat hersenen haarvaten verschillende signaalroutes onderzoeken. In Hartz et al. ²¹, vonden we dat de peptide endothelin-1 snel en omkeerbaar verminderd P-gp vervoer functie in de haarvaten van de hersenen door te handelen via de endothelin receptor B (ET_B) receptor, stikstofoxide synthase (NOS) en proteïne kinase C, (PKC). In Bauer et al. ¹⁹, we toonden expressie van de nucleaire receptor pregnane X receptor (PXR) en toonde PXR-modulatie van P-gp expressie en vervoer functie in de haarvaten van de hersenen. In experimenten met transgene gehumaniseerd PXR muizen, we uitgebreid deze lijn van onderzoek en toonde in vivo aanscherping van het blok door upregulating P-gp via hPXR activering²⁵. In 2010, Hartz et al. ²⁶ gebruikt deze aanpak om te herstellen van P-gp eiwit expressie en vervoer van activiteit in transgene menselijke amyloïde precursor proteïne (hAPP) muizen die overexpress hAPP. Bovendien verminderd herstellen van P-gp in hAPP muizen aanzienlijk bèta amyloid (Aβ)₄₀en Aβ₄₂hersenen niveaus.

Naast het studeren signaalroutes, kunnen geïsoleerde hersenen haarvaten worden gebruikt voor het bepalen van de veranderingen in de capillaire permeabiliteit die wij capillaire lekkage noemen. In het bijzonder wordt de bepaling van de lekkage Texas Red gebruikt ter beoordeling van de lekkage van de fluorescente kleurstof Texas Red van de capillaire lumen in de tijd en deze gegevens worden vervolgens gebruikt voor het analyseren van lekkage tarieven. Verhoogde capillaire lekkage tarieven in vergelijking met die van controle haarvaten geven wijzigingen in de fysieke integriteit van de bloed – hersen barrière-². Dit is waardevol, want er talrijke ziekte staten gekoppeld barrière ontwrichting, BV zijn., epilepsie, multiple sclerose, ziekte van Alzheimer en traumatische hersenen letsel^{27,28,29, 30}. Andere groepen hebben ook gebruikt voor geïsoleerde haarvaten te onderscheiden signaalroutes die eiwit expressie en vervoersactiviteit van proteïnen^{31,32,33,34regelen, 35},^,36,^,37. Tot slot, wij zijn blijven om het optimaliseren van deze methode voor de isolatie van menselijke hersenen haarvaten en onlangs, toonden wij verhoogde P-gp expressie op het menselijke bloed – hersenbarrière bij patiënten met epilepsie in vergelijking met inbeslagneming-gratis controle individuen³⁸ . Samen genomen, tonen deze ontwikkelingen dat geïsoleerde hersenen haarvaten als een veelzijdig model om te studeren barrièrefunctie kunnen dienen.

Verschillende in vivo, ex vivoen in vitro de bloed – hersen barrière-modellen zijn gebruikt in basisonderzoek en industriële drug screening, hoofdzakelijk met het doel van de tests van de drug levering aan de hersenen^{39,40,41 ,42,43,44}. Naast geïsoleerde ex vivo de haarvaten van de hersenen omvatten actuele modellen van de bloed – hersenbarrière in silico modellen, in vitro de cultuur van de cel van geïsoleerde capillaire endothelial hersencellen of vereeuwigd cellijnen uit verschillende soorten, in vitro cultuur van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) dat onderscheid in hersenen capillaire endotheliale cellen en microfluidic modellen op een chip.

In silico modellen zijn het meest gebruikt in Geneesmiddelenontwikkeling voor het selecteren van drugkandidaten op basis van het voorspelde absorptie, distributie, metabolisme en uitscheiding (ADME) eigenschappen. Methoden zoals kwantitatieve structuur-eigenschap relatie (QSPR) en kwantitatieve structuur-activiteit relatie (QSAR) modellen zijn populaire methoden in high-throughput screening van bibliotheken gebruikt om te voorspellen hersenen penetratie van drugkandidaten ^{45 , 46}. deze modellen zijn nuttig voor scherm moleculen voor barrière penetratie eigenschappen.

Betz et al. ⁴⁷ opgericht monolayers van gekweekte capillaire endothelial hersencellen als een in vitro -systeem van het bloed – hersen barrière-model. In vitro cel cultuur modellen met behulp van vers weefsel of vereeuwigd endothelial cellijnen zoals menselijke cerebrale microvessel endotheliale cellen (hCMECs) kunnen een ander high-throughput screening hulpmiddel voor hersenen penetratie of mechanistische studies. Echter, hersenen capillaire endothelial cel cultuur modellen ontbreken de fysiologische schuifspanning van de bloedstroom in de capillaire lumen, zijn beperkt in het algemeen biologische complexiteit en ondergaan veranderingen in expressie en lokalisatie van belangrijke barrière onderdelen zoals tight junction eiwitten kanalen oppervlakte receptoren, vervoerders, enzymen en ion^48,49,50. Omgekeerd, endotheel monolayers afgeleid van hPSCs, hebben lage sacharose permeabiliteit in vergelijking met hCMEC/D3 culturen en gepolariseerde expressie van sommige vervoerders van de bloed – hersen barrière, celadhesie-moleculen en strakke kruispunten^51, bevatten ⁵². echter deze cellen ook onderhevig is aan veranderende eigenschappen in de cultuur, en het systeem moet worden gevalideerd voor haar recapitulatie van in vivo barrière eigenschappen⁵².

Nieuwere tendensen in de bloed – hersenbarrière onderzoek omvatten met behulp van 3D weefselkweek systemen tot kunstmatige haarvaten, met behulp van de orgel-op-spaander technologie voor het genereren van microfluidic apparaten, of met behulp van de holle vezel technologie^{53, 54 , 55}. kunstmatige haarvaten, hebben echter aanzienlijk grotere diameters (100 – 200 µm) dan hersenen haarvaten (3-7 µm). Vandaar, de shear krachten in vitro doen niet volledig lijken op de in vivo situatie. Dit wordt behandeld in “blood-brain-barrier-on-a-chip” microfluidic apparaten, waar kunstmatige membranen formulier “bloed” en “brein” compartimenten en vloeistoffen door deze apparaten genereren microfluidic shear krachten worden gepompt. Ook zijn mede culturen van endotheliale cellen in verschillende combinaties met astrocyten en vasculaire zachte spiercellen ook gebruikt met de holle vezel technologie te herscheppen Rheologische parameters aanwezig onder in vivo voorwaarden^{56 , 57 , 58}. het is echter onduidelijk hoe goed dit model dat andere eigenschappen van de bloed – hersenbarrière zoals vervoer, metabolisme, signalering en anderen weerspiegelt. Deze kunstmatige capillair en chip modellen zijn geschikt voor high-throughput screening van drugs, maar de cellen die worden gebruikt voor het genereren van deze modellen kunnen ook worden gewijzigd tijdens de cultuur.

Bevroren en vaste hersenen segmenten of primaire hersenen capillaire endothelial celculturen zijn extra modellen die kunnen worden gebruikt voorhet bestuderen van de menselijke microvasculature^5,59,60,^,61. Bijvoorbeeld, immunohistochemistry van vaste hersenweefsel wordt gebruikt om te bepalen eiwit lokalisatie en expressie in gezonde vergeleken met zieke weefsel.

Naast weefsel segmenten en de in vitro -modellen kunnen zoals hierboven beschreven, vers geïsoleerde hersenen haarvaten worden gebruikt om het bestuderen van de bloed – hersenbarrière functie. Beperkingen van dit geïsoleerde capillaire model omvatten de moeilijkheid om op te halen van de verse menselijk hersenweefsel, afwezigheid van neuronen, astrocyten en een relatief tijdrovend isolatie-proces. Een voordeel van het geïsoleerde hersenen capillaire model is dat dit model veel overeenkomsten vertoont met de situatie in vivo en daarom kan worden gebruikt voor het karakteriseren van de barrièrefunctie en dysfunctie. Nog belangrijker is, kan het ook worden gebruikt om te onderscheiden van signalering mechanismen met behulp van een veelheid aan tests en moleculaire technieken^3,19,62,^,63.

Ons laboratorium heeft toegang tot beide verse en diepgevroren menselijk hersenweefsel door het centrum van Sanders-Brown op veroudering (IRB #B15-2602-M)⁶⁴. In dit verband lijkschouwingen volgen een standaardprotocol, hersenen worden verkregen < 4 h, en alle procedures in overeenstemming zijn met de NIH Biospecimen richtsnoeren voor beste praktijken⁶⁵. Deze unieke toegang krijgen tot menselijk hersenweefsel, wij opgericht en een protocol om te isoleren van de hersenen haarvaten van menselijk hersenweefsel die in een hoog rendement van intact, haalbare menselijke hersenen haarvaten resulteert geoptimaliseerd. Twee gemeenschappelijke eindpunten van belang zijn de eiwituitdrukking en activiteit te bepalen. In dit verband hebben wij en anderen verschillende tests die kunnen worden gebruikt met geïsoleerde hersenen haarvaten aan studie eiwit expressie en activiteitenniveaus vastgesteld. Deze testen omvatten westelijke bevlekken, eenvoudige Western assay, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), omgekeerde transcriptie polymerasekettingreactie (RT-PCR), kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR), zymography, vervoer activiteit testen, en capillaire lekkage testen. Deze tests kunnen onderzoekers te bestuderen veranderingen in functie als barrière in menselijke pathologische voorwaarden, trajecten waaraan eiwit expressie en activiteit te bepalen, en identificeren van farmacologische doelstellingen voor de behandeling van de bloed – hersen barrière gekoppeld ziekten.

Genomen samen, vers geïsoleerde hersenen haarvaten kunnen dienen als een robuuste en reproduceerbare model van de bloed – hersenbarrière. Vooral, kan dit model worden gecombineerd met veel verschillende testen om te bepalen van een breed scala van eindpunten te bestuderen barrièrefunctie.