Liposomen met single-keten amfifielen, vertonen met name de vetzuren, verschillende eigenschappen ten opzichte van deze met diacylphospholipids als gevolg van de unieke chemische eigenschappen van één keten amfifielen. Hier beschrijven we technieken voor de voorbereiding, zuivering, en gebruik van liposomen bestaat gedeeltelijk of geheel van deze amfifielen.
Liposomen met single-keten amfifielen, vertonen met name de vetzuren, verschillende eigenschappen vergeleken met degenen met diacylphospholipids als gevolg van de unieke chemische eigenschappen van deze amfifielen. In het bijzonder verbeteren vetzuur liposomen dynamische karakter, als gevolg van de relatief hoge oplosbaarheid van single-keten amfifielen. Liposomen met vrije vetzuren zijn ook gevoeliger voor zout en divalente kationen, als gevolg van de sterke wisselwerking tussen de carbonzuur hoofd groepen en metaalionen. We illustreren hier technieken voor voorbereiding, zuivering en gebruik van liposomen bestaat gedeeltelijk of geheel van één keten amfifielen (b.v., oliezuur zuren).
Liposomen of blaasjes – compartimenten begrensd door dubbelgelaagde membranen bestaat uit amfifiele lipiden – hebben gebruik in talrijke biomedische toepassingen gevonden als leverende voertuigen voor farmaceutische producten, modellen van celmembranen, en voor de ontwikkeling van synthetische cellen. Wij en anderen hebben ook liposomen werkzaam als modellen van primitieve celmembranen in vroege leven. 1 , 2 , 3 , 4 typisch, in dergelijke systemen hanteren wij één-keten amfifielen die bevatten slechts één lipide koolwaterstof staart (b.v., oliezuur), zoals deze moleculen eenvoudiger zijn te synthetiseren zonder het voordeel van de enzymen van de gecodeerde eiwit moderne cellen in dienst.
Liposomen bestaat uit single-keten lipiden zijn vergelijkbaar met die gevormd uit diacylphospholipids (bijvoorbeeld1-palmitoyl-2-oleoyl –sn– glycero-3-fosfocholine of POPC) in die zin dat de grens is samengesteld uit dubbelgelaagde membranen. Liposomen gevormd uit een klasse van lipiden kunnen een opgeloste nettolading, kunnen behouden en worden ingekrompen en gezuiverd door verschillende technieken. Aantal belangrijke verschillen het gevolg zijn van de unieke chemische kenmerken van single-keten lipiden. Blaasjes gevormd door fosfolipiden zijn stabiele over een brede pH-bereik, terwijl vetzuur blaasjes zijn slechts stabiel bij een neutrale mild standaardschijf pH (ca. 7-9), die bepaalde pH buffer vesikel voorbereiding vereist. Allermeest naar de tijd, kan deze buffer ook specifieke oplosbare molecules voor de inkapseling van het vesikel, die beide functionele materialen (bijvoorbeeldRNA) kunnen bevatten voor de verzuilde biochemische reacties of eenvoudige fluorescente kleurstoffen (bijvoorbeeld, calceïne ) voor de karakterisering van het vesikel.
De aanwezigheid van slechts een enkele koolwaterstof keten produceert een membraan dat is zowel meer luchtdoorlatend opgeloste stoffen, evenals dynamischer. Bovendien, de carbonzuur hoofd groep aanwezig zijn in de resultaten van de vetzuren in blaasjes die meer gevoelig zijn voor de aanwezigheid van zout en divalente kationen (bijv., Mg2 +). Magnesium is een van de belangrijkste divalente kationen voor het katalyseren van biochemische reacties in protocells voor oorsprong-van-leven studies. In vroege leven, voorafgaand aan de evolutie van geavanceerde eiwit enzymen, kan RNA zijn geweest van het dominante polymeer, als gevolg van zijn dubbele vermogen om zichzelf te repliceren en katalyse uitvoeren. Een representatief voorbeeld van een magnesium-vereisen RNA gerelateerde reactie is niet-enzymatische RNA kopiëren, eerst gedemonstreerd in de jaren 1960. 5 wanneer chemisch geactiveerde RNA-nucleotiden (dat wil zeggen 2-methylimidazolide nucleotiden) aan een bestaande primer-template-complex koppelen, de 3′-hydroxylgroep van de primer aanvallen de 5′-fosfaat van een aangrenzende geactiveerde monomeer verplaatsen de verlaten groep (dat wil zeggen 2-methylimidazole), en vormen een nieuwe phosphodiester bond. Deze RNA kopiëren chemie vereist een hoge concentratie van Mg2 +, die worden in chelaatvorm moet te compatibel met vetzuur protocells. 6 een ander Mg2 +-afhankelijke reactie is dat gekatalyseerd door de hammerhead Ribozym, dat is misschien het beste gekarakteriseerd katalytische RNA. Deze Ribozym, die twee korte oligonucleotides kan worden aangemaakt, voert een zelf-decollete reactie die handig is om te controleren door een verschuiving van de gel. Als zodanig, is het vaak werkzaam als een model-Ribozym in oorsprong-van-leven studies. 7 als gevolg van een eis door deze Ribozym voor unliganded magnesium, liposomen zijn meestal gebouwd door een mengsel van vetzuren en glycerol esters van vetzuren, die meer stabiel aan magnesium. 8 , 9 in dit protocol presenteren we technieken die wij hebben ontwikkeld voor de voorbereiding, de manipulatie, de karakterisering van deze blaasjes en demonstreren van de toepassing van deze blaasjes als protocells host niet-enzymatische RNA kopiëren en hammerhead Ribozym katalyse.
Liposomen gevormd uit vetzuren hebben gesuggereerd door velen als mogelijke modellen voor primitieve cellen vanwege hun hoge permeabiliteit en dynamische eigenschappen. De carboxylic hoofd groep van één keten vetzuren kan alleen zelf-assemblage aan membranen in een beperkte pH-bereik en de resulterende membranen zijn heel gevoelig voor de aanwezigheid van zouten. Dientengevolge, vereisen vetzuur blaasjes verschillende voorbereiding en behandeling methoden vergeleken met fosfolipide blaasjes.
In dit protocol, hoewel we oliezuur gebruiken als een voorbeeld voor de vorming van de liposomen, andere lange keten onverzadigde vetzuren (C14) en derivaten daarvan (ca. myristoleic zuur, Palmitoleïnezuur en de overeenkomstige alcoholen en glycerol-esters) vormen ook blaasjes na de dunne film rehydratie methode, zolang het totale vetgehalte boven de cmc en de pH van de buffer hydratatie is ligt dicht bij de pKa van de vetzuren in het membraan. Andere dan tris-HCl buffer in dit protocol gebruikt, werden andere systemen van de buffer (ca. bicine, fosfaat, boraat) gemeld bij het vetzuur vesikel vorming, hoewel blaasjes gevormd in fosfaat of boraat buffer meestal vrij lekke13 zijn. De resulterende vetzuur blaasjes na rehydratie zijn polydisperse en multilamellar, maar gemakkelijk worden omgezet in kleine monodispers unilamellar blaasjes door extrusie zoals beschreven. In vergelijking met ultrasoonapparaat als een alternatieve methode voor het genereren van kleine blaasjes, biedt extrusie meer opties voor de controle van de grootte van het vesikel door verschillende porie grootte membranen toe te passen. Blaasjes na extrusie zijn meestal iets groter dan de poriegrootte van het membraan, maar door het verhogen van het aantal cycli van de extrusie, blaasjes met een smaller grootteverdeling en een gemiddelde grootte dichtbij de poriegrootte van het membraan kunnen worden verkregen.
Om functionele protocells synthetiseren, moeten vetzuur blaasjes host specifieke biochemische reacties ten gevolge van de inkapseling van RNA of andere bouwstenen. De dunne film rehydratie methode biedt een gemakkelijke manier om vorm blaasjes met gewenste ingekapselde materialen. Echter de efficiëntie van de inkapseling is relatief laag, en een groot deel van kostbare materialen zoals RNA zijn meestal verloren tijdens het zuiveringsproces. In sommige gevallen kan de efficiëntie van de inkapseling bescheiden worden verbeterd door herhaalde bevriezen-ontdooien cycli voor extrusie. Microfluidic methoden voor de bereiding van de hoge opbrengst van fosfolipide liposomen toestaan voor bijna 100% inkapseling efficiëntie, maar soortgelijke methoden hebben nog geen ontwikkeld voor vetzuur blaasjes.
Wanneer behandeling protocells met chelaatvormige of gratis Mg2 +, zuivering na magnesium oplossing optellen en repurification voordat elk tijdstip zorgt voor de verwijdering van gelekte ingekapseld materialen die van invloed kan zijn op de nauwkeurigheid van de reactiesnelheid metingen binnen de blaasjes. Aangezien elke reiniging ten minste 10 min duurt om goede scheiding en voor het verzamelen van vesikel breuken, de analyse van snelle reacties is moeilijk, en de reactie moet worden gestopt voordat de kolom repurification.
Het protocol dat wij hier presenteren is geschikt voor de bouw van vetzuur liposomen die host zijn van reacties die in primitieve cellen optreden kunnen na te bootsen. Onze protocollen inschakelen ook potentiële toepassingen in de ontwikkeling van biomedische toedieningssystemen en bioreactoren voor andere biochemische reacties.
The authors have nothing to disclose.
J.W.S. is een onderzoeker van het Howard Hughes Medical Institute. Dit werk werd gedeeltelijk gesteund door een subsidie (290363) van de Stichting Simons J.W.S. Zowel A.E.E. als K.P.A. erkentelijk voor steun van de Universiteit van Minnesota opstarten middelen.
sephorose 4B | SIGMA-ALDRICH INC | 4B200 | |
calcein | SIGMA-ALDRICH INC | C0875-10G | |
tris-HCl pH8.0 1M | LIFE TECHNOLOGIES CORP | AM9851 | |
citric acid | SIGMA-ALDRICH INC | 251275-500G | |
sodium hydroxide | SIGMA-ALDRICH INC | 71690-250G | |
potassium hydroxide | Sigma | 30614 | |
oleic acid | Nu-Chek | U-46-A | |
glycerol monooleate | Nu-Chek | M-239 | |
Liss Rhodamine-PE | LIFE TECHNOLOGIES CORP | L1392 | |
magnesium chloride | Fisher/Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
sequagel concentrate | National Diagnostics | EC-830 | |
sequagel DILUENT | National Diagnostics | EC-840 | |
15% TBE-UREA GEL | Thermo Fisher Scientific | EC68852BOX | |
urea | Sigma Aldrich | U6504-500G | |
titon-100x | SIGMA-ALDRICH INC | T9284-100ML | |
RNA primer | IDT | 5'Cy3-GCG UAG ACU GAC UGG | |
RNA template | IDT | 5'-AAC CCC CCA GUC AGU CUA CGC | |
hammerhead substrate strand | IDT | 5'Cy3-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC | |
hammerhead ribozyme strand | IDT | 5'GGC UCG ACU GAU GAG GCG CG | |
vesicle extruder set | AVANTI POLAR LIPIDS | 610000 | |
fraction collector | Gilson, Inc. | 171041 | |
96-well plates | Fisher | NC9995941/675 | |
plate reader | Molecular Devices | SpectraMax i3 | |
confocal microscope | Nikon | Nikon A1R MP Confocal | |
gel scanner | GE Healthcare Life Sciences | Typhoon 9410 scanner |