プロモーター キャプチャこんにちは-c: 高解像度, ゲノム プロモーターの相互作用のプロファイリング

1. ホルムアルデヒド固定 セルの準備: 2 x 10 の7セル実験あたりの最小値と開始。 文化で育つ細胞培養培地で細胞を再懸濁します。前のヴィヴォセル、1 x ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM)、10% (巻/巻) ウシ胎児血清 (FBS) で再懸濁します。 付着細胞培養培地を削除し、10% (巻/巻) FBS 室温 (RT; 20-25 ° C) で新鮮な媒体の 30.625 mL を追加します。 浮遊細胞の場合収集し、g と 20 ° C、3 分削除清 x 400 で細胞を遠心分離し、再 30.625 ml の 10% (巻/巻) 室温 FBS と媒体の細胞ペレットを中断 固体ティッシュ トリプシン (0.05% から 2.5%、最終濃度、細胞の種類に応じて) または単一細胞懸濁液を取得する均質化 dounce を使用します。この追加の手順後懸濁細胞のような細胞を扱います。 16% メタノール無料パラホルムアルデヒド (使用する直前のオープン アンプル) の 4.375 mL を最終濃度 2% (巻/巻) に追加します。ロッカーで穏やかな混合常温 10 分を修正しました。注意: パラホルムアルデヒドは有害化学物質です。適切な保健及び安全性の規則に従ってください。 1 M の冷たいグリシンを出来立ての 5 mL を追加することによって反応を抑制します。常温では、穏やかな揺動に 5 分のミックスし、時折反転と 15 分のため氷の上、孵化させなさい。 洗うし、固定セルを収集します。 付着性のセル上清、板壁に PBS pH 7.4 x 氷冷 1 の 10 mL を追加し、それを取り外します。PBS pH 7.4 x 氷冷 1 の 1 mL を追加し、セルはセル スクレーパーや 50 mL のチューブに転送を収集します。可能な限り多くの細胞を収集を 2 回繰り返します。まで氷冷 PBS を 50 mL 最終巻に追加します。 浮遊細胞の場合、遠心分離機細胞は培養上清を削除 760 x g で 5 分 4 ° C と 50 ml の氷冷 PBS pH 7.4 の細胞ペレットを再中断します。 400 x gと 10 分のための 4 ° C で細胞を遠心し、上清を慎重に取り外します。細胞ペレットは、スナップを液体窒素で凍結し、その後数ヶ月間-80 ° C で保存をすることができます。 2. セル換散 出来立ての冷たい換散バッファーの 50 mL の細胞ペレットを再停止 (10 mM トリス塩酸 pH 8、0.2% (集集) Igepal CA-630、10 mM の NaCl、および 1 つのタブレット プロテアーゼ抑制剤のカクテル) と混ぜます。氷上で 30 分間インキュベート、反転によって時折ミックスします。760 x gと 4 ° C、5 分で核を遠心し、上清を除去します。 3 hindIII 消化。 1.25 x 制限バッファー 2 細胞核を洗います。再 1 mL の冷たい 1.25 x 制限バッファー 2 の細胞ペレットと 1.5 mL チューブに転送を中断します。760 g と 4 ° C、5 分 x の核スピンし、上清を除去します。 再 1790 1.25 x 制限バッファー 2 μ L で細胞ペレットを中断します。制限バッファー 2 倍 1.25 の 358 μ L で 500 万セルを含む各 5 因数を作る。 Thermomixer で 37 ° C で 30 分間 1 分 (rpm) あたり 950 回転で 10% (重量/巻) SDS 因数と振る 11 μ L を追加します。細胞塊が表示する場合泡を回避、ピペッティングで切り離します。 10% の 75 μ L を追加因数と 950 rpm と、thermomixer で 15 分の 37 ° C に振るあたりトリトン X-100 (巻/巻)。細胞塊が表示する場合泡を回避、ピペッティングで切り離します。 12 μ L 100 U/μ L HindIII 100 の (合計で 1,200 台)/因数を追加し、37 ° C 一晩 (O/N) で、thermomixer で 950 rpm で揺れながらインキュベートします。 消化のコントロールの酵素 (未消化コントロール) を追加する前に新しいチューブのサンプル (各因数から 5 μ L) の 25 μ L を転送し、酵素 (消化コントロール) を追加した後、同じ手順を繰り返します。やあ-C のライブラリと同じ方法で両方のチューブを孵化させなさい。 次の朝 [因数あたり 100 U/μ L HindIII (500 台) の 5 μ L を追加し、thermomixer で 950 rpm で揺れながら 37 ° C 2 時間インキュベートします。 消化のコントロール: 消化と未消化のコントロール (3.5.1 を参照)、架橋反転 (手順 6)、フェノール: クロロホルム抽出と DNA の沈殿物 (ステップ 7) を実行します。 HindIII サイトにまたがるプライマーのペアを設計します。同じ地域でHindIII サイトにまたがっていないプライマーの別のペアを設計します。(Q PCR) の量的な PCR 用プライマーを設計 Primer3 を使用して (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) そして次のパラメーター。プライマーのサイズ: 最適な 20 (分: 18、最大: 27);プライマーの Tm: 最適な 60 (分: 57、最大: 63);プライマー CG % コンテンツ: 分: 20、最大: 80;増幅サイズ: RT-PCR 〜 100 bp (従来の PCR 〜 300 のため bp);ライブラリを mispriming: 人間 (人間プライマー) または齧歯動物と簡単 (マウス プライマー)。 4 平均 Cts (しきい値サイクル) を取得する Q pcr: Ct [D;H]、スパンのHindIII サイト [H]; プライマーのペアで消化サンプル [D] から得られるCt [D;-]、 HindIII サイト [-] の対象としていないプライマーのペアで消化サンプル [D] から得られるものCt [U;H]、 HindIII サイトにまたがるプライマーのペアで未消化サンプル [U] から得られるCt [U;-]、 HindIII サイト [-] にまたがるいないプライマーのペアで未消化サンプル [U] から得られるもの。として消化のパーセンテージを計算: % 消化 = 100-100/2(Ct[D,H]-Ct[D,-]) – (Ct[U,H]-Ct[U,-])。 4. 制限のフラグメントのビオチン化オーバー ハングします。 ビオチン化マスター ミックスを調製: 30.6 μ 10 x バッファー制限 2、H2O の 10.2 μ L (分子生物学グレード)、10 mM dCTP 7.65 μ、10 mM dGTP の 7.65 μ L、dTTP の 10 mM の 7.65 μ L、ビオチン 14 dATP 0.4 mM の 191.25 μ L、5,000 U/mL DNA ポリメラーゼの 51 μ L 私大 (Klenow) フラグメント。 60 μ L 分注、ミックスあたりビオチン化マスター ミックスを追加し、37 ° C 1 時間 700 rpm (thermomixer) 5 の揺れで孵化させなさい s、あらゆる 30 s。1 時間後に、氷上因数を配置します。 5. 核結紮 結紮マスター ミックスを調製: T4 DNA リガーゼ バッファー、10 Mg/ml のウシ血清アルブミンの 51 μ L x 10 の 510 μ L (100 x BSA)、水 (分子生物学グレード) の 1754.4 μ L と 1 U/μ L T4 DNA リガーゼの 127.5 μ L (材料の表を参照してください)。 479 μ L 分注ミックスあたり結紮マスター ミックスを追加し、, 5 の 700 rpm で揺れ 4 h の 16 ° C で s、thermomixer で 2 分毎。 室温 30 分間加温します。 6. 架橋反転 (高速遠心分離に適した) 50 mL 遠心管中のすべての因数を組み合わせます。 10 mg/ml の RNase A、ミックス、62.5 μ L を追加し、37 ° C で 30 分間インキュベート 10 mg/ml のプロティナーゼ K のミックス、300 μ L を追加し、37 ° C で 30 分間インキュベート 65 ° C で反応 O/N (または少なくとも 4 h) を孵化させなさい次の朝、10 mg/ml のプロティナーゼ K、ミックス、300 μ L を追加し、65 ° C で 1 時間インキュベート 7. DNA 精製 4337.5 μ TLE バッファー (10 mM トリス塩酸 pH 8.0; 0.1 mM EDTA pH 8.0) とミックスを追加します。 新しい 50 mL のチューブに RT と上部 (水性) 相の 3 分転送 9 ml 20,000 × gで 1 ボリューム (10 mL) フェノール pH 8.0、10 s、および遠心分離機の渦を追加します。注意: フェノールは有害化学物質です。適切な保健及び安全性の規則に従ってください。 2 mL の残りの水相に TLE バッファーを追加、渦 10 s と RT で 20,000 x gで 3 分間遠心転送新しいチューブに水相の 2.5 mL からステップ最終巻を作る 7.2 11.5 mL。下の (有機) 相を有するチューブを破棄します。 新しい 50 mL のチューブに RT で 20,000 × g 3 分転送 11 ml 上部 (水相) のフェノール: クロロホルム: イソアミル アルコール (25:24:1)、10 s、および遠心分離機の渦の 1 ボリューム (11.5 mL) を追加します。7.3 手順を繰り返します。総サンプル ボリューム今 13.5 mL になります。 3 M ナトリウム酢酸 pH 5.2 と 33.75 mL の氷冷 100% エタノール、ミックス、1.35 mL を加えると,-80 ° C、45 分間でまたはまたは-20 ° C で一晩 4 ° C で 20,000 × g 10 分間遠心、上清を除去、出来立て 70% (巻/巻) エタノール 1 mL にペレットを再停止、新しい管に転送します。 4 ° C で、フルスピードでベンチトップ遠心分離機で 3 分間遠心し、上清を除去します。 氷冷 70% (巻/巻) エタノール 1 mL にペレットを再停止し、7.7 の手順を繰り返します。10 分の 37 ° C でペレットを乾燥し、TLE バッファーの 650 μ L で再度中断します。二本鎖 DNA を定量化する蛍光アッセイを用いた DNA 収量を決定します。注: プロトコルは、凍結と数ヶ月間-80 ° c または-20 ° C、時間の短い期間でのサンプルを格納するスナップによってここで休止できます。 8. 品質コントロール DNA 電気泳動によるライブラリの整合性と結紮を監視します。0.8% アガロース/1 x TBE ゲル上のライブラリの実行 200 ng。DNA は、バンド 10 kb 以上として実行してください。 知られているセル型不変短い–長距離相互作用従来の pcr 法による検出します。テンプレート DNA PCR の反作用ごとの使用 100 ng。閉じると (3.7.1 を参照) 上記の説明に従って制限のサイトに向かって、PCR のプライマーを設計します。マウスと人間のやあ-C ライブラリの品質管理のためのプライマー シーケンスの表 1のとおりです。 フィルインと結紮制御: カットから産物を含むゲルのバンドを 8.2 を制御、ゲル抽出 DNA と同一のプライマーの組み合わせで 4 個別 PCR の反作用のテンプレートとして DNA を使用します。 Amplicons PCR 精製キットを使用してを浄化し、DNA 濃度を定量化します。 15 μ L の最終巻の各私アンプリコンの 4 つ消化反応 (HindIII []、NheI [b]、 HindIII + NheI [c] となしの酵素 [d]) の準備: 500 私アンプリコンの ng、10 x バッファー制限 2.1、10 Mg/ml のウシ血清アルブミンの 0.15 μ L の 1.5 μ L (100 x BSA)、と酵素 (HindIII []、NheI [b]、 HindIII + 水は NheI [c] や [d]) の 0.1 μ L (10 単位)。 37 ° C で 1 時間のダイジェスト、1.5% (重量/巻) アガロース/1 x TBE ゲルの消化反応を実行します。 9. DNA の断片化 新しいチューブにサンプルの 50.5 μ g を転送し、ライブラリ (10 μ g) の 130 μ L を各バイアルに追加することによって 5 超音波バイアル (材料の表を参照) に 655 μ。 分割サンプルの最終巻に TLE バッファーを追加します。~ 400 のサイズにせん断超-超音波発生装置で bp (材料表参照) 次のパラメーターを使用して: デューティー比: 10%;最大入射電力 (w): 140;バーストあたりのサイクル数: 200;時間: 55 s。 新鮮な 2 mL チューブに熱量のサンプルを収集します。 10. 両面 SPRI ビーズのサイズ選択 反転、によってよくミックス SPRI (固体相リバーシブル固定) ビーズ ソリューション ビーズ ソリューションの 1.85 mL を新しいチューブに転送し、15 分間 RT させる。 サンプルに水 (分子生物学グレード) の 350 μ L を追加 (最終巻 1 mL)。 SPRI ビーズ ソリューションの 600 μ L をサンプルに追加 (合計量 1.6 mL; SPRI dna 溶液の比率: 1 に 0.6)、常温では、5 分間インキュベートし、回転のサンプルを収集するために 2-3 秒のベンチトップ遠心分離機のサンプル。 ふたを開けて、磁気分離スタンド 5 分、転送上澄みを新しいチューブにサンプルを配置、ビーズを破棄します。 第 2 のサイズ選択手順 SPRI ビーズを集中: SPRI の転送 930 μ L を新しいチューブ ビーズ、上澄みを 5 分と廃棄のための磁気分離スタンドに配置。再 SPRI ビーズ ソリューションの 310 μ L でビーズを中断します。 サンプルに集中 SPRI ビーズ (ステップ 10.5) の 300 μ L を追加 (合計量 1.9 mL; 比 SPRI dna ソリューションは現在、0.9 に 1)、RT で 5 分間インキュベート、スピン サンプル 2-3 s. 慎重に開いているため、ベンチトップ遠心分離機で蓋、磁気分離スタンド 5 min のためにチューブを置き、上澄みを廃棄します。 磁気分離スタンドのサンプル チューブに作りたての 70% エタノール (巻/巻) 1 mL を加え、30 s、および破棄清間インキュベートします。2 回繰り返します。 37 ° c 以上 5 分追加 300 μ L サンプル、ミックス、TLE バッファーの thermomixer (管蓋オープン) でビーズを乾燥し、室温で 10 分間インキュベートします。 2-3 s のベンチトップ遠心分離機のサンプルをスピン、蓋を開けると磁気分離のチューブ スタンド 5 分転送場所新しいチューブに上清をオフにしてビーズを破棄します。 11. ビオチン/ストレプトアビジン プルダウン結紮製品の バッファーを準備: TB バッファー x 1 (0.05%; 1 M 塩化ナトリウム 0.5 ミリメートルの EDTA 5 mM トリス塩酸 pH 8.0 トゥイーン 20);ntb 通信バッファー (10 mM トリス塩酸 pH 8.0; 1 mM EDTA; 2 M の NaCl) x 21 x NTB のバッファー (5 mM トリス塩酸 pH 8.0; 0.5 ミリメートルの EDTA が 1 M の NaCl)。 新しい管に (材料の表を参照) のストレプトアビジン結合磁性体ビーズ 200 μ L を追加、1 分の磁気分離スタンド上に配置し、上清を除去します。 500 μ L × 1 TB バッファーのビード二度洗浄しなさい。 各ビオチン プルダウンの中に洗浄ステップ、最後修理と DNA の端の非結紮、dATP のテーリングおよびアダプター結紮手順でビオチンの除去は、対応するバッファーのビードを再中断、RT と 3 分間 15 rpm で回転、ベンチトップ遠心管内をスピン2-3 秒、3 分間磁気分離スタンドにチューブを配置し、上清を削除します。 再 2 x NTB バッファーの 300 μ L でビーズを中断します。ミックス ビーズとサンプル (600 μ L 容量) と 3 rpm で回転ホイール上で 15 分間室温でインキュベートします。 3 分の磁気分離スタンドでビーズを再利用し、明確な上澄みを削除します。200 μ L 1 x 結紮バッファーの最初 500 μ L の 1 x NTB バッファーで 2 回ビーズを洗浄します。再 10 x 結紮バッファーの 50 μ L で、ビーズを中断します。 12. 非結紮 DNA の両端にビオチンの修理と除去を終了します。 サンプル (合計で 50 μ L) を組み合わせて 2.5 mM dNTP ミックス (各 dNTP の 10 mM の 12.5 μ L)、18.1 μ l の 3,000 U/mL T4 DNA ポリメラーゼ、10,000 U/mL T4 PNK 18.1 μ 50 μ L 3.7 μ L 5,000 U/mL DNA ポリメラーゼの私の大きい (Klenow) フラグメント、、360.1 μ H2o. ミックスし、, 20 ° C 1 時間、5 の揺れで 700 rpm、thermomixer で 2 分毎で s。 磁気分離スタンドでビーズを再利用、明確な上清を除去、ビード TB バッファー x 1 の 500 μ L に二度洗浄しなさい。 1 x NTB バッファー、1 を 500 μ l 添加のワンウォッシュ後の 500 μ L でビーズを洗う x TLE。 磁気分離スタンドでビーズを再利用、明確な上清を除去および再 1 x TLE バッファーの 415 μ L でビーズを中断します。 13. dATP を尾行 制限バッファー 2、10 mM dATP の 5 μ L、5 U/μ L Klenow エキソ-マイナスの 30 μ L x 10 の 50 μ L とサンプル (415 μ L) を組み合わせます。 混合し、37 ° C、30 分、5 の揺れで孵化させなさい 700 rpm、thermomixer で 2 分毎で s。 磁気分離スタンドでビーズを再利用、明確な上清を除去、ビード TB バッファー x 1 の 500 μ L に二度洗浄しなさい。 1 x NTB バッファーを 500 μ l 添加でビーズを洗浄します。 14. アダプター結紮 ライゲーション反応バッファー x 1 の 200 μ L でビーズを洗う (材料の表を参照してください)。 再 1 x ライゲーション反応バッファーを 200 μ l 添加でビーズを中断します。DNA のリガーゼの 4 μ L を追加 (材料の表を参照) と 15 μ M の 16 μ L 中古焼なまし PE アダプター (PE アダプター 1 と PE のアダプター 2 の平等なボリューム (30 μ M で両方) を混合し、常温、いくつかの分間インキュベートによって PE アダプターをアニール済み)。室温で 15 分間インキュベートします。 磁気分離スタンドでビーズを再利用、明確な上清を除去、ビード TB バッファー x 1 の 500 μ L に二度洗浄しなさい。 1 x NTB バッファーを 500 μ l 添加でビーズを洗浄します。バッファーの制限、2 x 1 の 100 μ L で、洗ってビーズは再バッファー制限、2 x 1 の 50 μ L でビーズを中断し、新しいチューブに移します。 15. ハイ-C のライブラリの増幅 PCR マスター ミックスを調製: 5 x Phusion バッファーの 100 μ L6 μ L の 25 μ M PE PCR プライマー 1.0;6 μ L の 25 μ M PE PCR プライマー 2.0;14 μ dNTP ミックス (10 mM);Phusion ポリメラーゼ; 6 μ318 μ H2o. ミックス PCR マスター ミックス ビーズ (合計で 500 μ L)、50 μ L の 10 の因数で分割し、次の条件を使用して PCR によって増幅します。98 ° C で 30 代サイクルを 7: 10 98 ° c; s30 s 65 ° c;30 s 72 ° c72 ° C で 7 分 新しい管に PCR の反作用を収集し、新しい管にビーズの磁気分離スタンドと転送上清 (500 μ L) を取り戻します。 SPRI ビーズを用いたライブラリ DNA を浄化します。 スプリング ミックス ビーズ、新しいチューブにビーズの 460 μ L を転送し SPRI ビーズを PCR の反作用 (最終巻 950 μ L) の 15 分追加 450 μ L の RT にもたらす、常温では、5 分間インキュベート、回転のサンプルを収集するために 2-3 秒のベンチトップ遠心分離機のサンプル。 ふたを開けて、磁気分離スタンド 5 min のためにサンプルを置き、上清を除去します。 磁気分離スタンドでビーズを維持、ビーズの明確な領域上のチューブのサンプル、30 s、および破棄の上清を残し 70% エタノール (巻/巻) 1 mL を追加します。 15.4.3 倍の手順を繰り返します。 5 分以上 thermomixer (管蓋オープン) で 37 ° C でビーズを乾燥させます。 サンプルでは、ミックスに TLE バッファーの 51 μ l 添加し、thermomixer で 950 rpm で揺れ、37 ° C で 10 分間インキュベートします。 2-3 s のベンチトップ遠心分離機のサンプルをスピン、蓋を開けると磁気分離のチューブ スタンド 5 分転送場所新しいチューブに上清をオフにしてビーズを破棄します。 こんにちは C ライブラリの濃度を定量化します。PCR の拡大の 7 ラウンド後定期的にこんにちは C ライブラリの 500-1,500 ng を取得します。 16. ハイブリッド ソリューションのキャプチャ 注: ブロックとバッファー (SHS1 4) 以下の解決策が、SureSelect キット (材料の表を参照してください)。 新しい管にこんにちは C ライブラリの 1 μ g に転送 500 ng 真空濃縮器のサンプルを蒸発させると (真空圧 45 ° C;材料表を参照してください: レベル 30.0、ランプ 5) 乾燥するまで。 再 3.6 μ H2O (分子生物学グレード)、ブロック 1、ブロック 2、2.5 μ L とカスタム ブロックの 0.6 μ L の 2.5 μ L を追加することにより蒸着こんにちは C ライブラリを中断します。 新しい PCR チューブ ストリップの井戸にサンプルを転送、PCR キャップ ストリップを閉じるし、氷の場所します。(ハイ-C の DNA) の「D」とラベル。 交配バッファーを準備: 12.5 μ SHS1 バッファー;SHS2 バッファーの 0.5 μ LSHS3 バッファーの 5 μ LSHS4 バッファーの 6.5 μ L。 65 ° c、thermomixer で 5 分間インキュベートします。新しい PCR チューブ ストリップの井戸の中へ転送、PCR キャップ ストリップと閉じて (交配バッファー) の”H”としたラベルで維持します。 新しい PCR チューブ ストリップの井戸の中へミックス 5 μ L ビオチン化 100 ng/μ L の RNA プローブ (-80 ° C で融解使用の直前に氷の上のストア);SRNase B (RNase 阻害剤) の 0.5 μ L と 1.5 μ H2O (分子生物学グレード)。 PCR チューブ ストリップ PCR キャップ ストリップと氷の場所を閉じます。ラベルには”R”(RNA) のため。 次のパラメーターを使用して PCR マシンを設定します。95 ° C で 5 分間65 ° c; 25 hふた加熱;29 μ L の PCR の反作用ボリューム。できるだけ早くすべてのプロシージャの間にメモ: 進みます PCR マシンをサンプルの蒸発を避けるために実行しています。 PCR マシンで”D”PCR チューブ ストリップを置き、PCR 機械の蓋を閉じるし、PCR 反応を開始します。PCR プログラム 65 ° C に達すると、PCR 機械の蓋を開き、PCR マシンで”H”PCR チューブ ストリップを配置します。PCR 機械の蓋を閉じるし、開く PCR 機械の蓋、場所”R”PCR チューブ PCR マシンのストリップ PCR マシンを終了 3 分間インキュベートします。 2 分後に PCR 機械の蓋と PCR チューブのすべてのストリップを開きます。よく”R”にも”R”、その後、すべてのボリュームにも”D”のも”H”の 13 μ L を転送します。反応をミックスに 3 回上下ピペット PCR チューブ ストリップを閉じる、削除”H”と”D”PCR チューブのストリップ、PCR 機械の蓋を閉じる。24 h 65 ° C で反応を孵化させなさい。 17. プロモーターのフラグメントを含む分離結紮製品 注: 次の手順は SureSelect アダプター キットおよびライブラリ (効能表を参照) を実行する推奨します。 事前事前に洗浄バッファー 2 65 ° C でサンプルごとの 1.5 mL を温めます。 新しい管にストレプトアビジン結合磁性体ビーズ (材料表参照) 60 μ L を追加、1 分の磁気分離スタンドに置き、上清を除去します。 ビーズ x 結合バッファー 1 の 200 μ L で 3 回洗います。注: 結紮製品のプロモーターを含むポスト キャプチャ分離中に洗浄ステップごとに再中断ビーズ対応するバッファーで、RT、回転ホイール上 15 rpm 3 分間回転、そっとスピンを収集する 2-3 秒のベンチトップ遠心管内サンプル、場所磁気分離のチューブ スタンド 3 min, と削除の上清。 再結合バッファー x 1 の 200 μ L でビーズを中断します。PCR マシンを開き、PCR チューブ (中に PCR プログラムがまだ実行されている) を除去し、磁気ビーズのチューブにハイブリダイゼーション反応を転送します。常温 3 rpm で回転ホイール上で 30 分間インキュベートします。 磁気分離スタンドでビーズを再利用し、明確な上澄みを削除します。再洗浄バッファー 1、ミックスの 500 μ L にビーズを中断し、thermomixer で 950 rpm で揺れながら 20 ° C で 15 分間インキュベートします。 3 分の磁気分離スタンドでビーズを再利用し、明確な上澄みを削除します。ミックスの再洗浄バッファー 2 の 500 μ L にビーズを中断、および、thermomixer で 950 rpm で揺れながら 65 ° C で 10 分を孵化させなさい。17.5 倍の手順を繰り返します。 磁気分離スタンドでビーズを再利用、明確な上澄みを除去し、再バッファー制限 2 x 1 の 200 μ L でビーズを中断します。磁気分離スタンドでビーズを再利用、上清を除去および再バッファー制限 2 x 1 の 30 μ L にビーズを中断します。 18. PCHi C ライブラリ増幅 PCR マスター ミックスを調製: 5 x PCR のバッファー (バッファー Phusion) 60 μ、25 μ M PE PCR プライマー 1.0、25 μ M PE PCR プライマー 2.0、dNTP ミックス (10 mM)、Phusion ポリメラーゼの 3.6 μ L および H2o. 190.8 μ 8.4 μ L の 3.6 μ L の 3.6 μ L ミックス PCR マスター ミックス 50 μ L、および次の条件を使用して PCR 増幅の 6 の因数でビーズ (合計で 300 μ L)、除算:30 98 ° c s4 サイクルの: 10 98 ° c、30 秒 65 ° c、30 s 72 ° c s72 ° C で 7 分 収集新しい管ですべての PCR の反作用、磁石のビーズを再利用、上澄みを転送 (300 μ L; PCHi C ライブラリが含まれています) で新しい管へ。 15.4 未満上記の手順に従って SPRI ナノビーズ PCHi C ライブラリを浄化します。 PCHi C ライブラリの濃度を定量化します。