Införliva en endotelceller pärla groning Assay pericyter
Summary
Detta protokoll presenterar en roman i vitro pärla assay som mer modeller på lämpligt sätt processen för i vivo groning angiogenes genom att införliva pericyter. Denna ändring gör det möjligt för bead analysen till mer troget recapitulate heterotypic cellulära interaktioner mellan endotelceller och väggmålning celler som är kritiska för angiogenes.
Abstract
Angiogenes är tillväxten av nya blodkärl från redan existerande kärlsystemet och är en viktig komponent i många biologiska processer, inklusive embryogenes och utveckling, sårläkning, tumörtillväxt och metastasering, och okulär och kardiovaskulära sjukdomar. Effektiv i vitro modeller som recapitulate biologin av angiogenes behövs för att på lämpligt sätt studera denna process och identifiera mekanismer i förordningen som kan riktas i slutändan för nya terapeutiska strategier. Bead angiogenes analysen har visat tidigare för att sammanfatta flera stadier av endothelial groning in vitro-. En begränsning av denna analys är dock avsaknaden av endothelial – väggmålning cell interaktioner, som är nyckeln till molekylär och fenotypiska regleringen av endotelceller fungera i vivo. I protokollet ges här presenterar en metod för införlivandet av väggmålning celler i pärla angiogenes analysen och visar en tight sammanslutning av endotelceller och pericyter under groning in vitro. Protokollet beskrivs också en metod för effektiv ljuddämpning av målgener med siRNA i endotelceller för mekanistiska studier. Helt och hållet, detta protokoll ger ett in vitro- test som lämpligare modeller de olika celltyper som är inblandade i groning angiogenes, och ger en mer fysiologiskt relevant plattform för terapeutiska bedömning och roman upptäckten av mekanismer för angiogenes förordning.
Introduction
Angiogenes är avgörande för lämpliga embryogenes och sårläkning, och den spelar också viktiga roller i många sjukdomar inklusive cancer progression1 och koronar sjukdom. 2 , 3 ha en bättre förståelse för hur angiogenes uppstår under normal utveckling, och hur det reaktiveras i patologisk sammanhang, är avgörande för utveckling av nya, effektiva therapeutics. Trogen i vitro modeller som sammanfatta de viktigaste stegen och celltyper inblandade i angiogenes i vivo behövs för att tillåta forskare att bättre karakterisera de molekylära mekanismer som driver angiogenes och göra nya upptäckter i endotel förordning.
Nakatsu och Hughes har optimerat en spirande pärla analysmetod som de har visat genomgår de många kända stadierna av groning angiogenes. 4 , 5 syftet med metoden presenteras här är att bygga på analysens optimerad av Nakatsu och Hughes genom att införliva perictyes i analysen, så att rollerna parakrin och juxtracrine av väggmålning celler i endotelceller groning kan införlivas i romanen angiogenes studier. Pericyter är väggmålning celler som definieras av deras roll som celler som upprätthåller nära fysisk kontakt med endothelial celler på grund av deras att vara inbyggda i vaskulär basalmembranet. 6 pericyter och endotelceller bedriver komplex överhörning via signalering vägar, inklusive Notch signalering, Ang-Tie2, PDGFRβ, TGFRβ och många andra. 7 , 8 musmodeller bristfällig i dessa signalvägar visar dålig pericyt täckning av utveckla kärlsystemet i embryogenes, vilket leder till dålig vaskulär remodeling och dysfunktionella kärlsystemet. 7 dessutom rollen av pericyter i patologisk angiogenes är viktigt men ofta under-uppskattat. En unik funktion i tumör kärlsystemet är exempelvis att fartygen är mer omogna, läckande och dysfunktionella på grund av dålig pericyt täckning. 9 det har föreslagits att närvaron eller frånvaron av pericyter dramatiskt påverkar fenotypen av tumor blodkärl och är en viktig mediator av Svaren till antiangiogenetisk och antitumöreffekt terapier. 9 således inklusive rollen av pericyter i in vitro- analyser är nyckeln till mer fullständigt fånga de viktiga mekanismerna av endothelial förordning.
Det finns många i vitro och ex vivo analyser för närvarande anställd att studera angiogenes, finns det brister att överväga i varje. Vissa, såsom endothelial spridning och endotel migration-analyser, är alltför förenklad och fokusera på en endotelfunktion i en isolerad miljö på vävnadsodling plast. 10 andra analyser sker i en mer 3 dimensionell (3D) miljö, såsom Matrigel tube bildandet analysen,10 men dessa analyser är fortfarande onyanserade och fokusera mer på förmågan av endotelceller att migrera och bilda de novo vaskulär strukturer, i motsats till groning från redan existerande kärl. Dessutom, ingen av dessa analyser införliva väggmålning celltyper. Det finns ex vivo modeller såsom ring aorta analysen som inkorporerar pericyter närvarande i det mottagande organet, men genetisk manipulering av dessa modeller är mycket mer utmanande på grund av nödvändigheten av att generera knockout eller transgena musmodeller av den vägar av intresse. Kornet groning assay är idealiskt eftersom det modeller endothelial groning, spridning, migration och även anastomos och lumen bildas i en 3D matrix. 4 analysen möjliggör troget mekanistiska bedömning av många olika stadier av groning, samtidigt tillåta för direkta genetisk modifiering av endotelceller eller pericyter i en mer kontrollerad miljö. De fibrin blodproppar som innehåller de spirande pärlorna kan vara enkelt fast, målat och avbildas i olika skeden av groning; dessa groddar kan också placeras i en levande imaging kammare att utföra realtid avbildning av groning. Den metod som presenteras här är idealisk för att studera grundläggande mekanismer av angiogenes via i djup fenotypning och grundlig analys av de vägar som aktiveras under angiogenes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll presenterar en metod för att karakterisera de komplexa steg och heterotypic cellulära interaktioner skottillväxt angiogenes genom att aktivera forskaren att anställa genetiska och bildgivande metoder att genomföra grundlig mekanistiska undersökningar. När du utför analysen, är det viktigt att effektiv endothelial beläggning av pärlor sker under pärlan agitation steg. Stackars endothelial beläggning kommer att göras tydligt, om pärlorna inte verkar ha en golf boll-liknande grov yta nästa mo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Drs. Victoria Bautch och Joshua Boucher för bra diskussioner och rådgivning på att optimera standard pärla groning assay villkor och en spirande assay färgning protokoll. S.H.A. stöddes delvis av ett stipendium från National Institute of General Medical Sciences under tilldela 5T32 GM007092.
Materials
| Sterile Pipette tips | VWR | ||
| Pipettors | Eppendorf | ||
| Complete EGM2 Media Bullet Kit | Lonza | CC-3162 | HUVEC Media |
| MEM | Gibco | 11095114 | 10T1/2 Media |
| DMEM | Gibco | 11965118 | NHLF Media |
| Tissue culture-grade PBS | Gibco | 14190-144 | Magnesium and calcium free |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | For lifting HUVEC |
| Trypsin | Life Technologies | 15050065 | For lifting 10T 1/2 and NHLF |
| Customs siRNAs | Sigma | ||
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | |
| HUVEC | Lonza | C2517A | |
| 10T 1/2 | ATCC | ||
| NHLF | ATCC | ||
| Cytodex 3 microcarrier beads | Sigma | C3275 | |
| Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates | Corning | ||
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Thrombin | Sigma | t9549 | |
| Aprotinin | Sigma | a3428 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | ||
| Tissue culture incubator and hood | |||
| 24-well glass bottom plates | MatTek | P24G1.513F | Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable. |
| Sterile Filtration Device |
References
- Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86 (3), 353-364 (1996).
- Semenza, G. L. Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders. Annu Rev Med. 54, 17-28 (2003).
- Zhang, Z. G., Chopp, M. Neurorestorative therapies for stroke: underlying mechanisms and translation to the clinic. Lancet Neurol. 8 (5), 491-500 (2009).
- Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 65-82 (2008).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50 (3), 311-322 (1995).
- Sims, D. E. The pericyte–a review. Tissue Cell. 18 (2), 153-174 (1986).
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Tattersall, I. W., et al. In vitro modeling of endothelial interaction with macrophages and pericytes demonstrates Notch signaling function in the vascular microenvironment. Angiogenesis. 19 (2), 201-215 (2016).
- Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
- Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
- Popson, S. A., et al. Interferon-induced transmembrane protein 1 regulates endothelial lumen formation during angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (5), 1011-1019 (2014).
- Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 438 (7070), 937-945 (2005).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
