Включение Pericytes в эндотелиальных клеток шарик прорастания Assay
Summary
Этот протокол представляет Роман в vitro шарик пробирного которые более надлежащим образом моделирует процесс в vivo прорастания ангиогенеза путем включения pericytes. Это изменение позволяет assay шарик к более точно охарактеризовать гетеротипичной клеточных взаимодействий между эндотелиальных клеток и росписи клетки, которые являются критическими для ангиогенеза.
Abstract
Ангиогенез является рост новых судов от ранее существовавших сосудистую и является важным компонентом многих биологических процессов, в том числе эмбриогенеза и развития, заживление ран, рост опухоли и метастазов, и глазной и сердечно-сосудистых заболеваний. Эффективным в vitro модели, которые пилки биологии по ангиогенез необходимо надлежащим образом изучить этот процесс и выявления механизмов регулирования, которые могут быть в конечном итоге направлены роман терапевтических стратегий. Assay ангиогенеза шарик была продемонстрирована ранее напомнить несколько этапов эндотелиальной прорастания в пробирке. Однако, этот assay ограничены отсутствием из эндотелия – росписи клеток взаимодействия, , которые являются ключевыми для молекулярных и фенотипические регулирование эндотелиальных клеток функционировать в естественных условиях. Протокол здесь представляет методологии для включения росписи клеток в assay ангиогенеза шарик и демонстрирует туго ассоциации эндотелиальных клеток и pericytes во время прорастания в пробирке. Протокол также подробно методологию для эффективного подавления целевых генов, с помощью малых интерферирующих РНК в эндотелиальных клетках механистический исследований. Вообще этот протокол обеспечивает пробирного в пробирке , что целесообразнее модели типов различных клеток, участвующих в прорастания ангиогенеза и обеспечивает более физиологически соответствующую платформу для терапевтических оценки и Роман Открытие механизмы регуляции ангиогенеза.
Introduction
Ангиогенез жизненно важное значение для соответствующих эмбриогенеза и заживление ран, и он также играет ключевую роль в многочисленных заболеваний, включая рак прогрессии1 и ишемической болезни. 2 , 3 наличие лучшего понимания как ангиогенез происходит во время нормального развития, и как она активируется в патологических условиях, имеет решающее значение для развития романа, эффективной терапии. Верный в vitro модели, которые резюмировать важные этапы и типы клеток, участвующих в ангиогенеза в естественных условиях необходимы для позволяют исследователям лучше характеризуют молекулярные механизмы вождения ангиогенеза и сделать новые открытия в эндотелиальных регулирования.
Nakatsu и Хьюз оптимизировали прорастания assay шарик, который они продемонстрировали, проходит стадии многие известные прорастания ангиогенеза. 4 , 5 цель метода, представленные здесь — развить assay оптимизирован Nakatsu и Хьюз путем включения perictyes в assay, так что роли паракринными и juxtracrine росписи клеток в эндотелиальных клеток прорастают могут быть включены в Роман ангиогенеза исследования. Pericytes являются росписи клетки, которые определяются их роли как клетки, которые поддерживают закрывать физический контакт с эндотелиальных клеток вследствие их встроенных в сосудистой базальной мембраны. 6 Pericytes и эндотелиальных клеток участвовать в сложных кросс talk через сигнальные пути, включая Notch сигнализации, анг-Tie2, PDGFRβ, TGFRβ и многие другие. 7 , 8 мыши модели дефицит этих сигнальных путей демонстрации охват бедных перицит развивающихся сосудистую в эмбриогенезе, приводит к плохой сосудистого ремоделирования и неблагополучных сосудистую. 7 Кроме того, роль pericytes в патологический ангиогенез является важным, но часто недооценивают. Например уникальная особенность опухоли сосудистую является, что сосуды более незрелых, Дырявый и неблагополучных из-за плохой перицит покрытия. 9 было предложено что наличие или отсутствие pericytes значительно влияет на фенотип опухоли кровеносных сосудов и является важным посредником ответов антиангиогенных и противоопухолевой терапии. 9 таким образом, включая роль pericytes в в vitro анализов является ключом к более полностью захватить важные механизмы регуляции эндотелия.
Хотя есть много in vitro и ex vivo анализов, в настоящее время работают для изучения ангиогенеза, есть недостатки рассмотреть в каждом. Некоторые, такие как эндотелиальные распространения и эндотелиальных миграции анализов, чрезмерно упрощенный и сосредоточиться на одной функции эндотелия в изолированной обстановке на культуре ткани пластик. 10 другие анализы встречаются в более 3 Настройка трехмерной (3D), такие как assay формирования Matrigel трубки,10 но эти анализы еще упрощенная и больше сосредоточиться на способности эндотелиальных клеток мигрировать и формируют de novo сосудистой структуры, в отличие от прорастания от ранее существовавших сосудистую. Кроме того ни один из этих анализов включают типы росписи клеток. Есть ex vivo модели, такие как assay аорты кольца которые включают pericytes в орган принимающей, но генетическая манипуляция этих моделей является гораздо более сложной в связи с необходимостью создания моделей нокаут или трансгенные мыши пути, представляющих интерес. Шарик прорастания пробирного идеально, потому что он моделирует эндотелиальной прорастания, распространения, миграции и даже анастомоза и Люмене формирования в матрице 3D. 4 assay добросовестно позволяет механистический оценки многих различных этапов прорастания, пока все еще позволяющ для прямой генетической модификации эндотелиальных клеток или pericytes в более контролируемых условиях. Сгустков фибрина, содержащие прорастания бусины можно легко фиксированной, витражи и образы на разных стадиях прорастания; Эти ростки также могут быть помещены в живой тепловизионные камеры для выполнения в реальном времени изображений прорастания. Методологии, представленные здесь идеально подходит для изучения основных механизмов по ангиогенез через в глубине фенотипа и тщательный анализ путей, активирована во время ангиогенеза.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол представляет метод для характеризующих сложные этапы и гетеротипичной клеточных взаимодействия прорастания ангиогенеза, позволяя исследователь использовать генетические и изображений подходы для проведения тщательных расследований механистическим. При выполнении а…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Drs. Виктория Bautch и Джошуа Буше за полезные обсуждения и консультации по оптимизации стандартных шарик прорастания пробирного условий и прорастания assay пятнать протокол. S.H.A. частично поддержали грант от национального института Генеральной медицинских наук под награду 5T32 GM007092.
Materials
| Sterile Pipette tips | VWR | ||
| Pipettors | Eppendorf | ||
| Complete EGM2 Media Bullet Kit | Lonza | CC-3162 | HUVEC Media |
| MEM | Gibco | 11095114 | 10T1/2 Media |
| DMEM | Gibco | 11965118 | NHLF Media |
| Tissue culture-grade PBS | Gibco | 14190-144 | Magnesium and calcium free |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | For lifting HUVEC |
| Trypsin | Life Technologies | 15050065 | For lifting 10T 1/2 and NHLF |
| Customs siRNAs | Sigma | ||
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | |
| HUVEC | Lonza | C2517A | |
| 10T 1/2 | ATCC | ||
| NHLF | ATCC | ||
| Cytodex 3 microcarrier beads | Sigma | C3275 | |
| Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates | Corning | ||
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Thrombin | Sigma | t9549 | |
| Aprotinin | Sigma | a3428 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | ||
| Tissue culture incubator and hood | |||
| 24-well glass bottom plates | MatTek | P24G1.513F | Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable. |
| Sterile Filtration Device |
References
- Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86 (3), 353-364 (1996).
- Semenza, G. L. Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders. Annu Rev Med. 54, 17-28 (2003).
- Zhang, Z. G., Chopp, M. Neurorestorative therapies for stroke: underlying mechanisms and translation to the clinic. Lancet Neurol. 8 (5), 491-500 (2009).
- Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 65-82 (2008).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50 (3), 311-322 (1995).
- Sims, D. E. The pericyte–a review. Tissue Cell. 18 (2), 153-174 (1986).
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Tattersall, I. W., et al. In vitro modeling of endothelial interaction with macrophages and pericytes demonstrates Notch signaling function in the vascular microenvironment. Angiogenesis. 19 (2), 201-215 (2016).
- Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
- Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
- Popson, S. A., et al. Interferon-induced transmembrane protein 1 regulates endothelial lumen formation during angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (5), 1011-1019 (2014).
- Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 438 (7070), 937-945 (2005).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
