인간의 고속 스트레치 부상에 대 한 방법 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 96 잘 형식

1. 실리콘 해독 254 µ m 두께, 30.48 cm x 30.48 cm 실리콘 막 면도날과 아크릴 서식 파일을 사용 하 여 7.5 c m x 11 c m 사각형으로 잘라. 10 사각형 막 각 시트와 함께 할 수 있다. 실리콘에와 함께 제공 되는 종이 저장 합니다. 세포 막 이온된 (DI) 수 유리 비누로 욕조에 놓습니다. 한 번에 하나씩 적어도 20 gloved 손끝으로 적극적으로 막 문질러 s까지 오면서. Lathered 비누 가시 제거 될 때까지 실행 디 물 아래 막을 헹 구 십시오. 세포 막 (포장)에서 종이 중력 사이클에 압력솥에 누워. 각 실리콘 막 24 h. 사용에 대 한 60 rpm에서 궤도 통에 막 당 70% 에탄올의 250 mL에 에탄올, 폴 리 프로필 렌 등으로 반응 하지 않는 소재로 만든 컨테이너를 담근 다. 하나 이상의 막 단일 저장소에 배치 됩니다 또는 세포 막 궤의 바닥에 붙어 있으면 세포 막 플라스틱 피 펫 팁 그들의 환경에서 고 팁 랙 플라스틱 합니다. Gloved 손 가진 실리콘 막 막 당 디 물 250 mL에 전송 하 고 60 rpm에서 48 h에 대 한 궤도 통에 담가. 다시 종이 4 h 93 ° C 유리 오븐에 장소에는 막 하다. 종이에, 깨끗 하 고 건조 장소에 덮여 먼지에서 그들을 보호 하기 위해 종이의 또 다른 시트 멤브레인을 저장 합니다. 2. 플레이트 제작 플라즈마 치료 200 W 플라즈마와 96 잘 접시 탑 클리너 ( 재료의 표참조) 60에 대 한 높은 전력, 청소기 하단 사이드-업 플라즈마 내부 배치에 s. 형광 보라색 효과적인 플라즈마 형성 했다 나타내는 챔버의 창문을 통해 볼 수 있는지 확인 합니다. 이 본딩 기술은 Sunkara 외. 에서 적응 됩니다. 14 60 내 s, 1.5% (3-Aminopropyl) triethoxysilane (항) 20 분 디 물 200 mL에 접시 탑을 배치 하단 사이드 다운. 이 솔루션은 안정적인: 60 보다 더 준비 접시를 소개 하기 전에 s.주의: 항 증기 두건에서 작동 합니다. 플라즈마 치료 60 플라스마에서 추출 된 실리콘 막으로 청소기 높은 전력에 대 한 s. 5 분 더 이상 단계 2.2에서에서 20 분 기간 종료 전에 완료 되도록 플라즈마 처리 시간. 집게를 사용 하 여 플라즈마 처리 막 7.5 x 11 cm2 양피지 종이 사각형 위에 위치. 7.5 cm x 11 cm x 플레이트 제작 클램프의 아래 부분에 0.5 cm 알루미늄 석판을 맞춥니다. 집게를 사용 하 여 알루미늄 슬 래 브에 실리콘 막 및 양피지 종이 맞춥니다.참고:이 장치에 대 한 컴퓨터 지원 설계 (CAD) 파일 보충 코드 파일로 보충 자료에 제공 된 ‘ 프레스 다이-일반 3D. 단계 ‘. 재료의 관련된 법안에 제공 된 보충 표 1: 사용자 정의 내장 장치-BOM.xlsx. 플레이트 상판 항 목욕에서 제거 하 고 초과 솔루션을 떨쳐. 5 s 및 과잉의 물 떨어져 동요 200 mL 디 물 목욕으로 찍어. 5 s 및 과잉의 물 떨어져 동요에 대 한 다른 200 mL 디 물 목욕으로 찍어. 또 다른 접시 탑을 찍기 전에이 욕조에 물을 교체 합니다. 압축 공기를 사용 하 여 접시 탑을 완전히 건조. 플레이트 제작 클램프의 상단 부분에서 접시 탑을 놓습니다. 부드럽게 플레이트 제작 클램프를 플레이트 상단 및 실리콘을 함께 눌러 닫습니다. 적어도 1 h의 클램프 접시 사용, 먼지 로부터 보호 하기 전에 실 온에서 24 h에 대 한 치료를 하실 수 있습니다. 3. 스트레칭 접시 청소는 indenters.참고: 보조 그림 1을 참조 하십시오. Di 60 W 목욕 스타일 sonicator 실 온에서 물을 준비 합니다. 지원 하는 indenters의 꼭대기만 깊이의 적어도 1 m m.에 잠긴 거꾸로 sonicator 목욕 위에 indenter 블록 Sonicate 42 kHz에서 8 분 indenters. 타격 건조 압축 공기와 함께 indenters. Indenter 블록을 맞춥니다. 있도록 indenter 배열에 보고 스트레칭 장치 위에 생중계와 함께 카메라를 배치 합니다. indenters의 꼭대기에 초점.참고: 섹션 4, “막 스트레치 특성화”에 설명 된 설치는이 작업에 대 한 하나의 가능한 카메라 설치. 무대 클램프 (그림 1)를 사용 하 여 부상 장치의 무대에 접시를 장악 하 고 돔 빛에 배치 하는 장치.주: 악기 제어 소프트웨어에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오. 부상 장치를 제어 하는 컴퓨터의 바탕 화면에 있는 소프트웨어 아이콘을 클릭 하 여 인스트루먼트 컨트롤 소프트웨어를 시작 합니다. 실행 창에서 클릭 하 여 “in_vitro_neurotrauma.lvproj” 프로젝트를 실행 합니다. 프로젝트 창에서 모션 컨트롤을 시작 하 고 위치 추적기 가상 악기 (Vi)는 이름은 ‘motion_control.vi’ 및 ‘position_tracker.vi’, 각각, 그들을 두 번 클릭 하 여. 부상 장치를 둘러싼 케이지를 닫습니다. 모션 컨트롤 VI VI를 실행 하 고 아래쪽을 클릭 ‘ 근처 ‘ 낮은 문의 indenters의 2 mm 이내에 무대의 왼쪽된 위 모퉁이 있는 ‘화살표’ 버튼을 누릅니다. VI를 중지 하려면 ‘중지’ 버튼을 클릭 합니다.주의: 계속 손을 들 것의 장에 카메라를 조작 하는 경우 취소 합니다. 감 금 소는 감 금 소 문의 닫을 때에 스트레칭 장치에 파워를 제공 하는 도어 스위치와 적합 해야 한다. 프로젝트 창에서 마우스 오른쪽 ‘ 축 1’ 클릭. ‘대화형 테스트 패널’을 클릭 하십시오. 열리는 창에서 ‘ 대상 위치 ‘ 필드에 ‘500’ 단위를 입력 하 여 단계 크기 50 µ m를 설정. 녹색 단추를 클릭 ‘이동’ ‘ 대화형 테스트 패널 ‘ 창의 맨 아래에 반복 해 서 접시까지 먼저 어떤 indenters와 접촉 하는 게. 카메라에 의해 표시 되는 라이브 이미지에 연락처를 확인 합니다. 참고 세로 무대 위치에 보고 된 ‘ 대화형 테스트 패널 ‘ 창; 왼쪽 상단 이것은 연락처의 첫 번째 위치입니다. 모든 잘 했다 때까지 낮은 (3.2.6 단계에서 설명) 하는 대로 추가 indenters와 접촉. 필요한 경우 전체 접시를 보고 (부정적인 ‘ 대상 위치 ‘를 지정) 하 여 스테이지를 이동 하는 카메라를 이동 하 고 아래로. 참고 세로 무대 위치에 보고 된 모든 게시물 접촉 (이것은 전체 연락처 위치)에 있을 때 윈도우의 왼쪽 상단. 참고 첫 번째 연락처와 전체 연락처 위치 간의 차이. ‘대화형 테스트 패널’을 닫습니다. ‘모션 컨트롤 VI’ 실행 (단계 3.2.4 참조) 무대를 ‘위에’ 클릭 합니다. ‘중지’ 버튼으로 모션 컨트롤 VI를 중지 합니다. 무대는 그것의 여행의 상단에, 일단 장치를 비활성화 하려면 문을 엽니다. Indenter 블록의 모서리에 있는 설정된 나사를 조정 합니다. 연락처 처음, 그것을 낮은 만든 연락처 마지막 코너를 인상 반대 나사를 만든 코너에는 나사를 풉니다. 접시 무대, 높이, 기울기에 대 한 연락처 이미지 검사 indenters, 연결 하 고 indenter는 차단 (단계 3.2.9) 조정 될 때까지 무대를 낮추기의 과정을 반복 합니다. 무대와 블록 정렬 됩니다 때 모든 indenters 만들 것입니다 한 번에 문의. 장치를 비활성화 하려면 문을 엽니다. 타이 다운 나사 indenter 블록에 그들의 구멍에 삽입 하 고 그들을 강화. 블록 장소 (단계 3.2.4-3.2.8) 타이 다운 나사와 레벨 되는지 확인 합니다. 접시가 ‘ 대화형 테스트 패널 ‘에서 보고 무대 위치의 접촉. 이 들여쓰기 실험에 대 한 제로 위치 될 것입니다. indenters 기름칠 Indenter 블록 그냥 설정 되었습니다 아직 윤 활 되지는 경우 단단한 고무 패드를 청소 (7.5 c m x 11cm x 1.5 m m)와 부드러운, 닫 히 세포 거품 고무 패드 (7.5 c m x 11cm x 3 m m) 에탄올 배어 연구소 삭제 기능으로. 그들을 허용 공기 건조. 실험실 지우기 옥수수 기름에 담가 고 둔 한 광택에 단단한 고무 패드에 그것을 확산. 거품 패드에 기름을 전송할 단단한 고무 패드에 거품 패드를 두십시오. 7.5 cm x 11 cm x 0.5 cm 알루미늄 슬라브 폼 패드 위에 놓고 약 360 g (예를 들어, 각 물 45 mL 로드의 원뿔 관 6 개)의 밸러스트 무게와 로드 거품 패드에 단단한 고무 패드에서 오일의 일관 된 전송 되도록. 10 허용 거품 고무 패드를 전송 하는 석유에 대 한 s. Indenter 배열에 거품 고무 패드를 이동 합니다. 알루미늄 슬 래 브와 밸러스트 무게는 indenters의 끝에는 오일의 일관 된 전송 되도록 그것의 위에 배치 합니다. 10 수는 indenters을 석유에 대 한 s. 없는 접시부터 뻗어 되었습니다 경우 indenter 블록 설정 하 고 실험을 시작 하기 전에 테스트 플레이트 스트레칭, 처음으로 윤 활.참고:이 실험을 혼동에서 첫 번째 스트레칭 및 후속 뻗어 사이의 어떤 불일치를 방지 합니다. 이후 복 역, 각 스트레칭 하기 전에 단계 3.3.2-3.3.5만 반복 합니다. 접시를 스트레치. 3.3 단계에서 설명한 대로 indenters에 기름칠. 무대 클램프와 부상 장치의 무대에 접시를 보안 합니다. 불 임이 필요한 경우 문화 표면 방 공기에 노출 하지 않고 접시를 확보 하 여 뚜껑의 위치를 조정 합니다. ‘모션 컨트롤 VI를 사용 하 여 0 위치에 단계 낮은 ‘ (단계 3.2.4-3.2.6 참조). 0 위치는 3.2 단계 결정 됩니다. 그 창의 왼쪽된 위 모퉁이 있는 ‘화살표’ 버튼으로 실행 다음 고유한 파일 이름에 ‘위치 추적 6’에서 “파일 경로” 입력란에 파일 이름을 변경 합니다. 깊이 들여쓰기의 기간 설정 (일반적으로 1 ~ 4 밀리미터 및 30 ms, 각각, 최대 깊이 5 m m, 최소 15 ms) ‘부상 (mm)’ 및 ‘이동 제어판에서 VI’ 필드를 클릭 하 고 원하는 입력 함으로써 ‘ 부상 기간 (ms)’ 분야 값입니다. ‘운동 제어 패널 6’를 실행 하 고 ‘Injure’ 접시를 클릭 하십시오. 여행 가기 무대 ‘위에’를 클릭 하 여 이동 합니다. 다음 ‘중지’ 버튼으로 VI를 중지 하 고 문을 열어 부상 장치를 비활성화. 지정 된 최대 변위 적용 된 것인지 ‘위치 추적기 VI’에서 제시 하는 무대의 변위 역사를 검사 합니다. 그래프를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 Excel로 내보내기’를 클릭 합니다. 클릭 하십시오 ‘ 파일 | 저장 ‘으로 데이터를 저장. 4. 막 스트레치 특성화 각 indenter 흰색 고속 videography 고대비 배경을 제공의 상단에 쉬는 시간을 페인트.주의: 어디 그들은 확인 하는 indenters의 테두리를 페인트 하지 마십시오 격판덮개와 접촉. 3D는 poly(lactic acid) (PLA), 인쇄 또는 그렇지 않으면 조작, 각 잘에서 점 하 게 하는 원통형 스탬프. 실린더 5.9 m m 직경에서 및 높이, 높이 1.0 m m와 원통형 돌출 1.5 m m 직경 12.2 m m 위에 중심을 확인 합니다.참고: 3D 인쇄 모델 ‘ 스탬프. STL’ 보조 파일로 사용할 수 있습니다. 플라즈마 치료 접시 오른쪽-사이드-최대 60 스에서 실리콘 셀 문화 표면 활성화 s, 단계 2.1에서에서 설명 했 듯이. 고무 패드 또는 다른 부드러운 표면에 접시를 놓습니다. 프라임 스탬프에 작은 돌출 (단계 4.2 참조) 영구 마커 펜에서 잉크. 테스트를 잘으로 스탬프를 삽입 하 고 잉크의 좋은 전송 되도록 누릅니다. 모든 잘 전에 스탬프 프라임. Indenter 블록을 정렬 하 고 기름칠을 부상 장치 indenters (참조 단계 3.2 3.3). 부상 장치의 무대에 판 클램프. 부상 장치 위에 밝은 확산 축 빛 위치. 부상 장치 붐 스탠드에 고속 카메라 설정, 렌즈 바로 아래쪽으로 직면 하 고는 작은 번호 f-로 설정 하 고 그것을 설정. 카메라에 연결 된 컴퓨터에 카메라 소프트웨어를 시작 합니다. 프레임 속도 드롭 다운 메뉴에서에서 선택 2000 프레임 초당 셔터에 드롭 다운 메뉴, 선택 높은 콘트라스트 이미지를 생성 하는 빠른 노출 시간. 점선된 우물에 센터입니다. 보기의 필드는 3 x 4 격자에서 12 우물이 포함 되도록 카메라를 배치 합니다.참고:이 필드의 보기 처리량 및 해상도 1280 × 1024 이미지 간의 최적의 타협을 제공합니다. 0 포인트 접시 낮은 (단계 3.2.4-3.2.6 참조). 1-클릭 기록 ‘에 트리거’를 읽을 수 있도록 카메라 소프트웨어에 단추. 위치 추적기 VI (3.4.4 단계)을 시작 합니다. 밝은 확산 축 빛을 켜십시오. 3.4.6 단계에서 설명한 대로 접시를 들여쓰기. 밝은 확산 축 빛을 끄십시오. 카메라 제어 컴퓨터에서 찾을 들여쓰기 발생 하는 기록의 30 ~ 40 ms 윈도우: 카메라 소프트웨어에서 고속 비디오 재생 막대에 시작과 끝 화살표를 끌어. 저장을 클릭 합니다, 그리고 ‘ 파일 이름 ‘ 필드에 이름을 설정 ‘형식’ 필드에 ‘티파니’를 선택 하 고 ‘저장’을 클릭 합니다. 통해 보고 합니다. 최소한의 이미지에 대 한 TIF 파일 (시작) 기지개 하 고 가장 (피크 들여쓰기) 상태를 뻗어. 높이 너비의 두 이미지는 점의 측정, 피지 사용 하 여 최소한의 이미지를 열고 피크 스트레치 측면-의해-측면. 기본 사각형 선택 도구를 사용 하 여 클릭 하 고 끌어 이상 스트레칭 이미지에서 점 주위에 상자를 그립니다. 높이 너비를 측정 ‘ 분석 | 측정 ‘. 피크 스트레치 이미지에 같은 음에 도트에 대해 반복 합니다. 우물의 나머지에 대해 반복 합니다. 다음과 같이 x 와 y 방향에 있는 Lagrangian 스트레인을 계산.참고: 여기, Exx 는 x 방향에 라그랑주 스트레인, Eyy 는 y 방향에 있는 Lagrangian 스트레인, X 는 도트의 폭, Y 는 점, f의 높이 는 최종 이미지 (즉, 피크 들여쓰기 이미지), 그리고 초기 이미지 (즉, 사전 들여쓰기 이미지)를 나타냅니다 . 잘에 긴장을 확인 하는 두 값을 평균입니다. 5. 도금 배양된 세포 압력솥 궤 및 밸러스트 무게를 살 균을 위해 사용 됩니다. 플라즈마 치료는 실리콘 바닥 플레이트 오른쪽-사이드-최대 60 s (단계 2.1 참조). 즉시 15 분 동안 70%의 에탄올을 포함 하는 멸 균 쓰레기통에 접시 잠수함. 30 분에 대 한 별도 멸 균 쓰레기통에 버퍼링 하는 멸 균 인산 염 (PBS)에 번호판 잠수함 우물에서 PBS 발음 플라즈마 처리를 잃는에서 우물을 방지 하기 위해 한 번에 한 접시를 건조만.주의: 실리콘 바닥된 접시 pipetting 때 경직 된 플레이트 보다 덜 촉각 피드백을 제공 하 고 더는 피 펫의 끝을 차단 하는 것 소독된 판에 잘 당 0.1 mg/mL 폴 리-L-ornithine (PLO)의 100 µ L를 추가 합니다. 1 시간에 대 한 실 온에서 품 어. 100 µ L 살 균 PBS, 세포 현 탁 액 준비 될 때까지 두 번째 워시 우물에 떠나와 두 번 웰 스 린스. 안전 장갑을 사용 하 여 액체 질소 저장에서 hiPSCNs의 유리병을 제거 하 고 드라이 아이스에. 빨리 37 ° C 물 목욕에 유리병을 수송 하 고 정확 하 게 3 분에 대 한 해 동. 유리병을 소용돌이 친다 하지 마십시오. 살 균 후드, 부드럽게 유리병의 내용을 50 mL 원뿔 튜브 1 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 전송. 실내 온도 완벽 한 유지 보수 매체 (미디어 베이스 + 보충)의 1 mL와 함께 빈 극저온 유리병을 씻어. 초 당 약 한 방울에 drop-wise 50 mL 튜브에 미디어의 1 mL를 전송 합니다. 추가 하는 동안 부드럽게 튜브를 소용돌이 친다. 약 2 방울/s에서 50 mL 튜브에 실내 온도 완벽 한 유지 보수 매체의 8 mL를 추가 합니다. 튜브 캡 및 반전 2-3 번. hemocytometer 셀을 계산 합니다. 225000 셀/mL로 세포 현 탁 액을 희석 하는 데 필요한 추가 미디어의 볼륨을 계산 합니다. 부드럽게 플라스틱 (위의 계산) 세포 현 탁 액 25 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여의 관으로 미디어의 양을. 세포 현 탁 액에서 laminin의 10 µ g/mL를 달성 하기 위해 1000 µ L micropipette와 셀 서 스 펜 션의 1 mL 당 1 mg/mL laminin 주식의 10 µ L를 추가 합니다. 아래로 한 번 laminin, 사용 팁과 발음 다음 튜브 캡 하 고 튜브를 한 번 반전. 한 번에 한 접시는 접시에서 PBS 발음 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 각 우물에 hiPSCN 세포 현 탁 액의 100 µ L를 추가. 그래서 지역 당 세포 밀도 67,500 셀/cm2우물 0.33 c m2의 문화 영역이 있다. 첨부 파일 홍보 뿌리기 후 15 분 동안 실내 온도에 격판덮개를 휴식. 메 마른 문화 후드의 팬 진동 방지, 실험실 벤치에 덮여 접시를 놓습니다. 5% CO2와 37 ° C에서 문화를 품 어. 24 h, 완벽 한 유지 보수 미디어의 200 µ L로 우물을 채우는 전체 미디어 변화를 수행 합니다. 미디어의 100 µ L/2-3 일 마다 변경 반 수행 합니다. 6. 문화 부상 Indenter 블록을 정렬 하 고 단계 3.2에에서 설명 된 대로 제로 위치를 찾습니다. 3.3 단계에서 설명한 대로 indenters에 기름칠. (3.4.4 단계)에 ‘위치 추적기 VI’에 변위의 역사에 대 한 파일 이름을 설정 합니다. 상해의에서 매개 변수는 ‘모션 컨트롤 VI’ (3.4.5 단계)를 설정 합니다. 인큐베이터에서 부상 하 여 무대에 클램프 플레이트를 가져가 라. 방 공기에 문화를 노출 하지 않고 접시를 확보 하 여 뚜껑의 위치를 조정 합니다. ‘모션 컨트롤 6’를 사용 하 여 0 점 (단계 3.2.4-3.2.6)에 접시를 낮춥니다. ‘위치 추적기 VI’ 시작 (3.4.4 단계). 운동 제어 VI를 사용 하 여 (단계 3.4.6에서에서와 같이) 접시를. 가짜 뻗 기에만이 단계를 건너뜁니다. 무대는 맨 위로 돌아가기 모션의 범위 (단계 3.4.7 참조). 인큐베이터에 접시를 반환 합니다. 검사 하 고 변위 추적 (3.4.8 단계)로 저장 합니다. 7입니다. 현미경 2 µ g/mL Hoechst 33342 및 5 µ g/mL Calcein 오전 유지 보수 미디어에서 솔루션 얼룩 x 10을 준비 합니다. 각 얼룩 얼룩 솔루션 x 10의 20 µ L 스파이크와 함께 잘. 37 ° c.에 얼룩과 15 분 동안 품 어 넓은 필드 형광 이미지를 취득 합니다. 사용 하 여 기존의 FITC와 DAPI 세트 Calcein 오전 및 Hoechst 33342 신호를 각각 이미지를 필터링 합니다. 다 잘 이미징 시퀀스에는 10 분 이상 걸릴 것입니다, 문화의 건강을 유지 하기 위해 무대 최고 인큐베이터에서 접시를 묶습니다.참고: 10 배, 0.30 NA 렌즈 제공 합니다 충분 한 세부를 세포 생존 능력 및 형태에 대 한. 이 많은 밝은 소마의 일부 채도 발생 neurites의 좋은 시각화를 위해 이익 조정 합니다. 소마와 neurites 식별 하 녹색 Calcein 오전 채널에서 라이브 셀 이미지를 세그먼트. Soma의 식별을 지원 하기 위해 블루 Hoechst 33342 채널에서 핵 이미지를 사용 합니다.