トロンボキサン A2 受容体遺伝子の C924T 多型を勉強する方法

プロトコルは、キエーティ大学の医学研究倫理委員会のガイドラインに従います。 1. 試薬のセットアップ (PH 8.0) トリス EDTA (TE) バッファーを準備します。ビーカーに 200 μ L 0.5 M の EDTA のとトリス Cl 1 M の 1 つの mL を追加し、滅菌水で 100 mL にもたらします。TE バッファーの最終濃度: 10 mM トリス-Cl 1 mM EDTA。常温 (RT) を格納します。 原液電気泳動バッファー (TBE) x 10 の 1 L を準備します。トリス基地の 108 g、ホウ酸、55 g、EDTA の 40 mL を溶かす、ビーカーに 0.5 M (pH 8) し、滅菌水で 1 L のボリュームをもたらします。室温ストア ゲルのローディングの染料を準備します。プロムフェノール ブルーとキシレンシアノール FF、グリセリン、1 mM EDTA (pH 8) の 60 mL に 50 g の 0.25 g 純水や蒸留水、0.25 g を溶かし、滅菌水で 100 mL の容積をもたらします。(数ヶ月) のための 4 ° C または-20 ° C (長年) で格納します。 2% の agarose のゲルの 200 mL を準備します。それ新鮮なまたは、代わりに、ストアを使用は数週までの常温固化。 600 mL ビーカー 1 x TBE バッファーの 200 mL の寒天 4 g を溶解します。約 5 分間磁気ミキサーを使用して agarose が完全に中断されるまでかき混ぜなさい。 沸騰水または (約 10 分間、agarose を完全に溶解するまで) ホット プレート上の 2% アガロース溶液を加熱します。アルミ箔覆わ agarose のゲルとビーカー必要がありますに注意してください。また、熱は高温約 3-5 分電子レンジで覆いを取られたビーカー。 Agarose が完全に解散したことをチェック、磁気のミキサーを使用して 2% アガロース溶液を旋回します。注: agarose の粒子は完全な溶解の前に半透明の粒として表示されます。いくつかの分 (約 5-10 分) 粒子再熱する必要があります。 場合のストアド部分 agarose のゲル、ビーカーを熱、アルミ箔で覆われては、agarose まで (約 60 ° C) で湯浴が解散しました。パスツール ピペット「痕跡」凝固 agarose の表面からを注ぐ前に削除します。 2. DNA 精製 浄化を開始する前に、次を実行します。 ひと新鮮な全血サンプルを使用や軽度の動揺を適用する (37 ° C) で水バースの迅速に (約 2-3 分) のサンプルを冷凍血液を解凍して使用する前に RT に釣り合います。 新鮮なまたは解凍血液サンプル チューブを数回反転をミックスします。 溶出容量 100 μ L のサプライヤーのプロトコルに従うことによって精製の手順を開始します。 定量化し、260、280、320 で吸光度を測定する DNA の純度を計算する nm。 サンプルを希釈して分光光度計を校正するために、滅菌水を使用します。 DNA サンプルの濃度を計算するために次の数式を適用 (260 − A320) x 50 μ G/ml 倍の希釈倍率と DNA の純度を = = (260 − A320)/(280 − A320)、許容比1.7 と 1.9。 3. DNA のサンプルの Pcr 表 1に示すように、0.2 mL マイクロ増幅管で反応混合物の 25 μ L を準備します。 次の表 2に示されている増幅プログラム自動サーマルサイクラーを使用して浄化された DNA サンプルの PCR 増幅を行います。 PCR の拡大の終わりに、4 ° C で DNA サンプルを残すことによって PCR の反作用を停止します。 4。 PCR の製品の RFLP 選択した制限の酵素のダイジェスト PCR の製品表 3に示すように各サンプルのマスター ミックス ソリューションの 22.5 μ L を準備します。 PCR の製品の 2.5 μ L をピペットとフィルターのヒントを使用して、各サンプルの新しい PCR チューブに転送します。 ピペットとフィルターのヒントを使用して、各サンプルの PCR の製品を含むチューブに消化マスター ミックス ソリューションの 22.5 μ L を追加します。 4 h の 37 ° C で反応混合物 (マスター ミックス ソリューションおよび PCR の製品) を孵化させなさい。 5 PCR-RFLP 法試料のゲル電気泳動分析 汚れは 10 分 EtBr 用ゲルを 0.5 μ g/mL に臭化エチジウム (EtBr) を追加することによって agarose のゲルに紫外線 (UV) 光の下で視覚化することができます DNA にバインドします。注意: それはそれは潜在的な発がん性と変異原ため処理、ストレージ、および EtBr、処分時に手袋やその他の保護デバイスを使用する重要です。 所でよく櫛でゲル トレイに準備された agarose のゲルを注ぎ、それが固化するまで待ちます。 ジェル ボックス (電気泳動装置) に凝固 agarose のゲルを配置します。 ジェル ボックス 1 で塗りつぶす x TBE ゲルが覆われるまで。 ピペットとフィルターのヒント、agarose のゲルの井戸に増幅されたダイジェスト DNA (具体的には、各サンプルのロード 5 μ L とゲルのローディングの染料の 1 μ L) の 6 μ L をロードします。よく、サンプルと並行して別の DNA サイズ マーカーを追加します。 100 V で 20-30 分のためのゲルを実行します。 UV transilluminator とに裂かれた DNA のフラグメントまたは DNA サイズ マーカーとフラグメントを比較する未消化の PCR の製品を視覚化し、製造元の指示に従って撮影して結果を登録します。注意: は、UV 光源周り保護装置 (安全メガネまたは顔マスク) を使用します。