Específica y detección precisa de los Citrus Greening patógeno Candidatus liberibacter spp mediante PCR convencional en muestras de tejido de hoja de Citrus
Summary
Enverdecimiento de los cítricos es una enfermedad particularmente destructiva que afecta a cultivos de cítricos a nivel mundial. Presentado aquí es un método simple usando PCR y extracción de ADN genómica de tejido foliar cítricos para la identificación exacta y precisa de lo patógeno de enverdecimiento de los cítricos Candidatus liberibacter spp.
Abstract
Enverdecimiento de los cítricos, también conocida como huanglongbing, es una enfermedad destructiva de cítricos causando estragos en granjas de cítricos a nivel mundial. Esta enfermedad causa moteado asimétrica hoja amarilla, vena amarillamiento, defoliación, caries de la raíz y en última instancia, la muerte de la planta de cítricos. Cuando infectados, las plantas de cítricos con retraso en el crecimiento y producen flores fuera de temporada. Estas flores raramente rendir fruto, y aquellos que producen cítricos pequeñas, amargas y de forma irregular no son deseables. Esta enfermedad se transmite por el psílido asiático de los cítricos, Diaphorina citri y por el injerto de tejido infectado de cítricos. El patógeno tiene un período de incubación largo y variable dentro de la planta cítricos, a veces años, antes de que aparezcan los síntomas. Los intentos de cultivar este agente patógeno en vitro han tenido éxito, posiblemente debido a la baja y desigual concentración del patógeno dentro de infectados tejido cítricos, o porque es difícil replicar el medio ambiente las condiciones propicia para el crecimiento de el patógeno. Es muy difícil identificar la enfermedad antes de que se ha propagado, debido a su período de incubación largo y la incapacidad de los investigadores para el patógeno de la cultura. Como resultado, la enfermedad sólo se hace evidente después de repente destruir toda producción de un agricultor cítricos. Presentado aquí es un método para la detección precisa y específica del patógeno de enverdecimiento de los cítricos, Candidatus liberibacter spp. usando un kit de extracción de DNA genómico y PCR. Este método es simple, eficiente, rentable y adaptable para el análisis cuantitativo. Este método puede adaptarse para su uso en cualquier tejido cítricos; sin embargo, potencialmente está limitada por la cantidad de patógenos presentes en el tejido. Sin embargo, este método permitirá cítricos agricultores identificar plantas cítricas infectadas antes y frenar la propagación de esta enfermedad destructiva antes de que se propaguen aún más.
Introduction
Enverdecimiento de los cítricos, también conocida como huanglongbing, ha causado una pérdida significativa de árboles de cítricos. Un caso representativo es la Florida, donde pronostican la enfermedad causa una reducción del 70% en la producción de cajas de naranja de Florida de 244 millones de cajas en la temporada 1997-1998 a 70 millones de cajas a partir de la temporada 2016-20171. Más del 90% de los árboles de cítricos en Florida son infectados2, y se estima que la industria cítrica de Florida pierde alrededor de 1 billón de dólares cada año debido a enfermedades de cítricos, en donde enverdecimiento de los cítricos juega un papel importante3. Enverdecimiento de los cítricos se extiende principalmente por el invasor psílido asiático de los cítricos Diaphorina citri, pero también puede propagarse por injerto de tejido infectado. La enfermedad causa amarillamiento de las venas, moteado de la hoja amarilla asimétrica, defoliación prematura, muerte regresiva de ramas, caries de raíz y muerte de la planta. Lo importante, la enfermedad causa la planta de cítricos producir flores fuera de temporada, que rara vez producen fruta. El fruto que es producido por las plantas cítricas infectadas es inmaduros, verdes y amargo sabor4.
El propósito de este método es exactamente e identificar con precisión el móvil de la bacteria Candidatus liberibacter spp., el agente causativo del enverdecimiento de los cítricos, en el líber de árboles cítricos infectados5. ADN genómico se extrae tejido de la hoja entera, que contiene bacterias vivas. Este ADN genómico extraído se utiliza como plantilla para PCR convencional, donde se utilizan oligonucleótidos complementarios a la secuencia de ADNr 16S de la bacteria para amplificar esta secuencia. Oligonucleótidos complementarios a un gen FBOX cítricos se utilizan como un control de amplificación interno. Optamos por utilizar este método, porque se ha demostrado para tener éxito en la investigación anterior6.
Este método tiene la clara ventaja de ser simple, relativamente barato y puede realizarse en cualquier laboratorio de bioquímica normalmente equipada. Además, la PCR sigue siendo el método más preciso y exacto para la detección de este patógeno, debido a la dificultad de cultivo este patógeno7y capacidad del patógeno de sobrevivir y reproducirse durante años dentro de un anfitrión asintomático8. Muchos análisis PCR de diferentes especialidades se han utilizado para detectar con éxito este patógeno; sin embargo, la PCR convencional sigue siendo el ensayo más simple para la detección exacta y específica, especialmente en huéspedes asintomáticos8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es fundamental que se sigan todos los pasos exactamente para lograr condiciones experimentales óptimas. Tejido de hoja entera fue utilizado durante esta demostración; sin embargo, el protocolo puede ser modificado para incluir teóricamente cualquier tipo de tejido vegetal. Previamente, investigadores han extraído ADN genómico de tejido de la vena de la hoja, en lugar de tejido de hoja entera y consigue similares resultados11. Si la banda correspondiente al gen FBOX cítricos no compa…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Conceptualización, H.C. y Z. p. F.; Investigación, H. C., J. C y Z. p. F; Recursos, Z. p. F.; Escritura – proyecto Original, I. A. P.; Redacción, revisión y edición, I. A. P., J. C., H. C., S. L. T. y F. de p. Z.; Visualización, H. C.; Supervisión, Z. p. F.; Financiación de adquisición, Z. p. F y F. p. L.
Proyecto apoyado por Carolina del sur mejorar maestro calidad educación superior estado becado titulado, conocimiento de procesos de la planta mejorar medio grados ciencia docentes, estructuras y funciones a través de la participación en investigación en Ciencias de planta (planta Ciencia)
Fondos otorgados por el Reino Estados Departamento de Educación (CFDA número 84.367B)
Los autores desean dar las gracias a Dr. Nian Wang de la Universidad de Florida para proporcionar muestras de ADN genómicas de infectados Valencia Citrus sinensis .
Materials
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions |
| Liquid nitrogen | Air Products | N/A | |
| Mastercycler pro with control panel | Eppendorf | 6321000019 | |
| 1250 W Microwave | Panasonic | N/A | |
| 5424 table top centrifuge | Eppendorf | 05-403-93 | |
| Isotemp 215 digital water bath | Fisher scientific | 15-462-15Q | |
| Metal spatula | Sigma-Aldrich | Z283274 | |
| Mortar and pestle | Sigma-Aldrich | Z247464 | |
| LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Sterile 10 μL tips | TipOne | 1161-3730 | |
| Sterile 200 μL tips | TipOne | 1163-1730 | |
| Sterile 1250 μL tips | TipOne | 1161-1750 | |
| Variable Volume Pipettor Kit | VWR | 75788-460 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Agarose | IBI Scientific | IB70041 | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 17892 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38-212 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| μcuvette | Eppendorf | 6138000018 | |
| Stackable casting tray and combs | Carolina | 213655 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Mini-Sub Cell GT System | Bio-Rad | 1704487EDU | |
| Biospectrometer basic | Eppendorf | 6135000009 | |
| 0.2 mL PCR tubes | Fisher scientific | AB-0620 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3439 | |
| 2X Taq Green PCR Master Mix | Promega | M7122 | |
| Forward Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Reverse Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Water, PCR grade | Sigma-Aldrich | 3315953001 | |
| Gel Doc XR+ | Bio-Rad | 1708195 | |
| 1 KB+ DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 |
References
- Field Office, F. l. o. r. i. d. a. . Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size. , (2016).
- Singerman, A., Useche, P. Impact of citrus greening on citrus operations in Florida. Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , (2015).
- Spreen, T. H., Hodges, A. . The economic impact of HLB on the florida citrus industry. , (2012).
- UICEP. . Pathology. , (2013).
- Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria. Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).
- Fujikawa, T., Iwanami, T. Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium "Candidatus Liberibacter asiaticus" by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers. Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).
- Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. Co-cultivation of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ with actinobacteria from citrus with huanglongbing. Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).
- Department of Agriculture & National Agriculture Statistics Service. . Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015). , (2015).
- Hocquellet, A., Toorawa, P., Bové, J. M., Garnier, M. Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the β operon. Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).
- Mafra, V., et al. Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions. PLoS One. 7 (2), e31263 (2012).
- Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing. J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).
