여기, 우리는 고립 된 미토 콘 드리 아 및 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 유입의 측정에 대 한 두 개의 프로토콜을 제시. 고립 된 미토 콘 드리 아에 대 한 우리는 플레이트 리더 기반 Ca2 + 가져오기 세부 분석 결과 사용 하 여 Ca2 + 민감한 염색 칼슘 그린-5N. 경작된 한 세포에 대 한 우리 confocal 현미경 검사 법 방법 Ca2 + 염료 오전-2/로드를 사용 하 여 설명 합니다.
캘리포니아2 + 미토 콘 드리 아에 의해 처리 광범위 한 셀에서에서 생리 및 병 태 생리 과정을 조절 하는 중요 한 기능 이다. 정확 하 게 유입 및 캘리포니아2 + 미토 콘 드리 아에서의 경과 측정 하는 능력은 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 이러한 프로세스에 처리의 역할을 결정 하기 위한 중요 합니다. 이 보고서에서 우리는 고립 된 미토 콘 드리 아와 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 처리의 측정을 위한 두 가지 방법을 제시. 우리는 먼저 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 통풍 관은 Ca2 + 민감한 염료 칼슘 그린-5N을 사용 하 여 측정 하기 위한 플레이트 리더 기반 플랫폼을 선발. 플레이트 리더 기반 형식 circumvents 특수 장비에 대 한 필요 그리고 칼슘 그린-5N 염료 측정 캘리포니아2 + 절연된 조직 미토 콘 드리 아에서 적합. 우리의 응용 프로그램에 대 한 설명 통풍 관 Ca 미토 콘 드 리아2 + 마우스 심 혼 직물;에서 고립 된 미토 콘 드리 아에서의 측정 그러나,이 절차 간, 골격 근육, 뇌 등 다른 조직에서 격리 하는 미토 콘 드리 아에서 미토 콘 드리 아 캘리포니아2 + 이해 측정에 적용할 수 있습니다. 둘째, 우리는 미토 콘 드 리아 캘리포니아의2 + permeabilized 셀 Ca2 + 민감한 염료 오전-2/로드를 사용 하 여 2 차원 레이저 스캔 현미경을 사용 하 여 이미징 측정 confocal 현미경 기반 분석 결과 설명 합니다. 이 permeabilization 프로토콜 cytosolic 염료 오염, 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 +에서 변화의 특정 기록에 대 한 허용을 제거 합니다. 또한, 레이저 스캔 현미경 높은 프레임 속도를 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 다양 한 약물 이나 외부 솔루션에서 적용 시 약에 대 한 응답에서의 빠른 변화를 캡처 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 심장 myocytes 및 신경, 불멸 하 게 셀 선 등 1 차 셀을 포함 하 여 많은 세포 유형에 미토 콘 드리 아 캘리포니아2 + 글귀를 측정에 적용할 수 있습니다.
미토 콘 드리 아의 세포내 캘리포니아2 + 저장과 신호 중요 한 사이트입니다. 연구의 십 년간은 미토 콘 드리 아를 가져오고 캘리포니아2 + 1,2격리 능력을가지고 설명 했다. 그러나 미토 콘 드리 아,, 단지 수동 사이트의 캘리포니아2 + 저장 되지 않습니다. 미토 콘 드 리아 구획에서 캘리포니아2 + 대사 출력의 규칙을 포함 하 여 기본적인 신호 기능을 수행 하 고 있다 중재 미토 콘 드리 아 세포 죽음 통로의 활성화 검토 이전3. 신진 대사 조절에 대 한 캘리포니아2 + 의 활동을 강화 3 매트릭스 지역화 dehydrogenases tricarboxylic 산 주기 뿐만 아니라 호흡 사슬 복합물, 미토 콘 드 리아 에너지 생산4,5 증가 . 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 과부하 및 dysregulated 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 처리, 캘리포니아2 + 트리거 미토 콘 드 리아 침투성 전환 기 미토 콘 드리 아 내 막 permeabilization, 선도 (MPTP) 오프닝 공 막 잠재적인 손실, 미토 콘 드 리아 기능 장애, 부 종, 파열 하 고 궁극적으로, 죽음6,7,,89셀. 따라서, 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 신호 직접 영향을 미칩니다 셀룰러 삶과 죽음 통로 통해 대사 제어 및 MPTP 죽음 축.
최근 몇 년 동안, 거기는 급속 하 게 확장에 따른 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 역학의 연구에 관심 있는 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + uniporter 복잡 한의 분자 성분의 식별에 큰 부분, 미토 콘 드리 아 내 캘리포니아2 + 의 기본 모드는 막 운송업 자 미토 콘 드 리아 매트릭스 10,,1112로 가져옵니다. 이러한 구조 및 규제 소 단위는 uniporter의의 앞뒤로 유전자 타겟팅 미토 콘 드리 아 기능 및 역 기능 변조를 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 유입의 가능성을 가져 신분증과의 연구를 촉진 합니다 uniporter 복잡 하 고 미토 콘 드리 아 캘리포니아2 + 유입 질병13,,1415의 기여 금. 실제로, 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 신호는에 연루 되어 neurodegeneration, 그리고 암16,,1718, 심장 질환에서 배열 하는 질병의 다양 한 배열의 병 리 19,20.
미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 신호 물질 대사와 세포 죽음의 근본적인 중요성을 감안할 때 및 생물 학적 시스템의 광범위 한 도달 범위와 함께 해당 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 신호 영향, 미토 콘 드 리아 Ca2 + 평가 하는 방법 큰 관심의 유입은. 아니나 다를까, 다양 한 기술 및 미토 콘 드리 아 캘리포니아2 + 측정 도구 개발 되었습니다. 이러한 형광 캘리포니아2 +같은 도구를 사용 하는 메서드가 포함-민감한 염료21,22 및 유전자 인코딩 캘리포니아2 + 센서 미토 콘 드리 아, cameleon 및 aequorin23, 등을 대상으로 24. 이 기사의 목적은 다른 방법 및 미토 콘 드리 아 캘리포니아2 + 통풍 관 측정 될 수 있는 모델 시스템을 강조 하는. 우리는 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 유입 용량을 평가 하기 위해 두 가지 실험 방법을 제시. 예를 들어 심장 미토 콘 드리 아를 사용 하 여, 우리 플레이트 리더 기반 플랫폼 세부 측정 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 통풍 관을 사용 하 여 Ca2 + 민감한 염색 칼슘 그린-5N 절연된 조직 미토 콘 드리 아14에 적합 . 경작된 한 NIH 3T3 세포를 사용 하 여, 우리 또한 confocal 현미경 이미징 기반 분석 결과 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 캘리포니아2 + 민감한 염료 로드-2/오전25를 사용 하 여 permeabilized 셀에서의 측정에 대 한 설명.
여기, 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 유입 측정 하 두 가지 다른 방법을 설명 합니다. 플레이트 리더 기반 칼슘 그린-5N 방법 모니터 extramitochondrial Ca2 + 레벨 이며는 Ca2 + 이해 분석 결과 고립 된 미토 콘 드리 아에서의 측정에 적합 하다. 우리가 고립 된 murine 심장 미토 콘 드리 아에서 대표적인 결과 표시는,이 분석 결과 높은 미토 콘 드 리아 풍부한 간, 골격 근육 및 두뇌를 …
The authors have nothing to disclose.
이 작품 교부 미국 심장 협회 (J.Q.K.)에서 지원 했다.
Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors | Biotek | ||
Tissue Homogenizer | Kimble | 886000-0022 | |
22 x 22 mm coverslips | Corning | 2850-22 | |
96 well plate | Corning | 3628 | |
6 well plate | Corning | 3506 | |
Calcium Green-5N | Invitrogen | C3737 | |
MitoTracker green FM | Invitrogen | M7514 | |
Rhod-2, AM | Invitrogen | R1244 | |
DMSO | Invitrogen | D12345 | |
Pluronic F-127 | Invitrogen | P3000MP | |
D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
Sucrose | EMD Millipore | 8510 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
EGTA | Sigma | E8145 | |
Potassium chloride | Fisher | BP366-500 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma | P0662 | |
Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
L-malic acid | Sigma | M1125 | |
Calcium chloride | Sigma | C4901 | |
Potassium acetate | Fisher | BP364-500 | |
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
Phosphocreatine disodium salt | Sigma | P7936 | |
Saponin | Sigma | S7900 | |
Ru360 | Calbiochem | 557440 |