Analisi di afflusso del calcio mitocondriale in mitocondri isolati e cellule coltivate

I mitocondri sono siti critici di intracellulare Ca^{2 +} deposito e segnalazione. Decenni di ricerche hanno dimostrato che i mitocondri hanno la capacità di importare e sequestrare il Ca^{2 + 1,2}. Mitocondri, tuttavia, non sono meramente passive siti di^{Ca 2 +} storage. CA^{2 +} presso il compartimento mitocondriale svolge funzioni di segnalazione fondamentali tra cui la regolazione della produzione metabolica e l’attivazione delle vie di morte mitocondriale-mediata delle cellule, che è stata esaminata in precedenza³. Per la regolazione metabolica, Ca^{2 +} migliora l’attività di tre deidrogenasi localizzato matrice del ciclo dell’acido tricarbossilico, nonché complessi della catena respiratoria, per aumentare la produzione di energia mitocondriale^4,5 . Con sovraccarico mitocondriale di Ca^{2 +} e dysregulated mitocondriale Ca^{2 +} movimentazione, transizione di permeabilità mitocondriale di Ca^{2 +} trigger poro apertura (MPTP), che conduceva ad permeabilizzazione della membrana mitocondriale interna, perdita potenziale di membrana, la disfunzione mitocondriale, gonfiore, rottura e in ultima analisi, delle cellule morte^6,7,8,9. Così, mitocondriale di Ca^{2 +} segnalazione direttamente influisce sia vita cellulare e le vie di morte attraverso controllo metabolico e asse di MPTP-morte.

Negli ultimi anni, c’è stato rapidamente in espansione interesse per lo studio della mitocondriale Ca^{2 +} dinamica dovuta in gran parte per l’identificazione dei costituenti molecolari del Ca^{2 +} uniporter mitocondriale complesso, un’interna mitocondriale trasportatore di membrana che è una modalità primaria di Ca^{2 +} importare nella matrice mitocondriale ^10,11,12. Identificazione di queste subunità strutturali e regolamentari del uniporter ha portato avanti la possibilità di targeting geneticamente afflusso Ca^{2 +} mitocondriale per modulare la funzione mitocondriale e disfunzione e facilitato lo studio della contributo dell’uniporter complesso e mitocondriale Ca^{2 +} afflusso a malattia^13,14,15. Infatti, Ca^{2 +} segnalazione mitocondriale è stata implicata nelle patologie di una vasta gamma di malattie che variano dalla malattia cardiaca alla neurodegenerazione e cancro^{16,17,18, 19,20}.

Data l’importanza fondamentale di mitocondriale Ca^{2 +} segnalazione nella morte delle cellule e del metabolismo e combinata con la vasta portata dei sistemi biologici che mitocondriale di Ca^{2 +} segnalazione impatti, metodi di valutazione mitocondriale Ca^{2 +} afflusso sono di grande interesse. Non sorprendentemente, sono stati sviluppati una varietà di tecniche e strumenti per misurare mitocondriale Ca^{2 +} . Questi includono metodi che utilizzano strumenti quali fluorescente Ca^{2 +}-coloranti sensibili^21,22 e geneticamente codificato Ca^{2 +} sensori mirati ai mitocondri, come cameleon ed equorina^{23, 24}. L’obiettivo di questo articolo è quello di evidenziare diversi metodi e sistemi di modello in cui mitocondriale Ca^{2 +} l’assorbimento può essere misurato. Presentiamo due metodi sperimentali per valutare la capacità mitocondriale Ca^{2 +} afflusso. Utilizzando i mitocondri cardiaci come esempio, dettagliamo una piattaforma basata su lettore di piastra per la misurazione mitocondriale Ca^{2 +} assorbimento utilizzando il Ca^{2 +} sensibili tinta del calcio verde-5N che è adatto idealmente per i mitocondri del tessuto isolato¹⁴ . Utilizzando cellule in coltura NIH 3T3, descriviamo anche un saggio di basati su formazione immagine di microscopia confocale per misura di mitocondriale Ca^{2 +} in celle permeabilized utilizzando il Ca^{2 +} sensibile colorante Rhod-2/AM²⁵.