Identificatie van de skeletspieren satelliet cellen met immunofluorescentie met Pax7 en Laminin antilichamen

Skeletspieren is samengesteld uit multinucleaire spiercellen, genaamd myotubes, georganiseerd in de myofibers, die kracht en bewegingen door contractie genereren. Meest skeletspieren, met uitzondering van sommige craniofaciale spieren, zijn afgeleid van een tijdelijke embryonale structuur genaamd een Somiet¹. Myogenic voorlopercellen delamineren uit de epitheliale Somiet tot myoblasts. Myoblasts verder onderscheiden in myocytes die samensmelten tot myotubes multi genucleëerde myofibers vormen. Het hierboven beschreven proces heet myogenesis en wordt gekenmerkt door stoffelijk-gereglementeerde controle op de genexpressie. Myogenic precursoren express Pax3 en Pax7, terwijl myoblasts express MyoD en/of Myf5 en myocytes express myogenin en myosins^2,3. Spiergroei is een proces waarin myofibers groter worden door meer myonuclei op te nemen in bestaande vezels (hyperplasie) en door een toename van de spiervezel grootte (hypertrofie)⁴. Tijdens de spiergroei is er een duurzame bron van myogenic cellen, die cel van de stam eigenschappen hebben dat ze kunnen onderscheiden en zelf vernieuwen. Deze cellen zijn cellen van de satelliet op basis van hun fysieke locatie tussen het sarcolemma (celmembraan van de myofiber) en de basale lamina⁵genoemd. SCs krachtig bijdragen aan spiergroei in de juveniele fase (de eerste 2-3 weken van de postnatale muizen), maar geven in rust volwassen spier⁶geworden. Opmerkelijk is, kunnen zij zitten re-geactiveerd in reactie op spier verwondingen en differentiëren in nieuwe spiercellen te herstellen van de beschadigde spier⁷.

De cel van de stam-eigenschappen maken de studie van SCs relevant zijn voor zowel de fundamentele spier biologie en de therapieën van spier ziekten⁸. Dientengevolge, kan het een gebied van intens onderzoek in de afgelopen decennia is geweest. Een enorme vooruitgang is geboekt in de ontrafeling van de genetica en de epigenetica van SCs^9,10. Die betrokken zijn bij het opsporen en identificeren van SCs in situ technieken werden ontwikkeld en geoptimaliseerd langs de manier¹¹. Immunefluorescentie kleuring kan de identificatie van SCs door het gebruik van specifieke antilichamen, met inbegrip van die voor Pax7. Echter, de schaarste en de kleine grootte van de SCs gecombineerd met een sterke auto-fluorescentie van volwassen skelet spierweefsel maken de visualisatie uitdagend. Hier beschrijven we een immunefluorescentie kleuring protocol geoptimaliseerd voor muis spierweefsel voor Pax7 en op basis van een bestaande methode voor zebrafish spier¹². Bovendien is een Laminin antilichaam gemarkeerd met een aparte fluorophore aangewend om te identificeren van de basale lamina waaronder de SCs zich bevinden. Dit protocol maakt consequent de visualisatie van Pax7-positieve SCs en myogenic precursoren onder alle geteste fysiologische omstandigheden en ontwikkelingsstadia.