تحديد خلايا الهيكل العظمى والعضلات الأقمار الصناعية قبل الفلورة مع Pax7 والأجسام المضادة لامينين
Summary
تحديد دقيق للخلايا الأقمار الصناعية أمر ضروري لدراسة مهامهم تحت مختلف الظروف الفسيولوجية والمرضية. تعرض هذه المقالة بروتوكول لتحديد الخلايا الأقمار الصناعية على أقسام الكبار الهيكل العظمى والعضلات التي تستند إلى الفلورة تلطيخ.
Abstract
الفلورة هو وسيلة فعالة تساعد على التعرف على أنواع الخلايا المختلفة في أقسام الأنسجة. من أجل دراسة السكان الخلايا المطلوب، والأجسام المضادة لعلامات خلية محددة تطبق على أقسام الأنسجة. في الهيكل العظمى والعضلات الكبار، خلايا الأقمار الصناعية (المنبوذة) هي الخلايا الجذعية التي تسهم في إصلاح العضلات والتجدد. ولذلك، من المهم أن تصور وتتبع السكان خلية الأقمار الصناعية تحت ظروف فسيولوجية مختلفة. في استراحة الهيكل العظمى والعضلات، يقيم المنبوذة بين الصفيحة القاعدية وغشاء البلازما ميوفيبير. علامة شائعة استخدام لتحديد الطوائف المنبوذة في ميوفيبيرس أو في خلية ثقافة من البروتين مربع إقران Pax7. في هذا المقال، يقدم بروتوكولا الفلورة Pax7 أمثل في أقسام الهيكل العظمى والعضلات تقلل إلى أدنى حد تلطيخ غير محددة وأساسية. كما أضيف جسم آخر يعترف بروتين (لامينين) الصفيحة القاعدية للمساعدة في تحديد بروتوكولات مماثلة المنبوذة. يمكن أيضا استخدامها لأداء ضعفين أو ثلاثة إضعاف وضع العلامات مع Pax7 والأجسام المضادة للبروتينات إضافية للفائدة.
Introduction
الهيكل العظمى والعضلات مكونة من خلايا العضلات مولتينوكليتيد، ويسمى ميوتوبيس، نظمت في ميوفيبيرس، التي تولد القوة والحركات من خلال الانكماش. معظم عضلات الهيكل العظمى، باستثناء بعض عضلات الجمجمة، مستمدة من بنية جنينية مؤقتة تسمى سميط1. ديلاميناتي الخلايا السليفة شذوذ من سميط الظهارية لتصبح ميوبلاستس. ميوبلاستس كذلك تفرق في myocytes الصمامات لتصبح ميوتوبيس لتشكيل ميوفيبيرس متعدد الأنوية. العملية المذكورة أعلاه تسمى ميوجينيسيس وتتميز بالتحكم ينظم وقتيا من التعبير الجيني. السلائف شذوذ التعبير عن Pax3 و Pax7، بينما myoblasts التعبير عن دخولها و/أو Myf5 وميوسيتيس عن2،ميوجينين وميوسينس3. نمو العضلات هو عملية التي ميوفيبيرس تصبح أكبر من خلال دمج ميونوكلي أكثر في الألياف الموجودة (تضخم) وزيادة في الألياف العضلية الحجم (تضخم)4. وخلال نمو العضلات، هناك مصدرا مستداماً لشذوذ الخلايا التي تحتوي على خصائص الخلايا الجذعية حيث يمكن التفريق وتجديد ذاتي. وتسمى هذه الخلايا خلايا الأقمار الصناعية استناداً إلى موقعها الفعلي بين ساركوليما (غشاء الخلية ميوفيبير) و الصفيحة القاعدية5. نشاط الطوائف المنبوذة تسهم في نمو العضلات في مرحلة الأحداث (أول 2-3 أسابيع من الفئران بعد الولادة)، ولكن أصبحت هادئة في استراحة العضلات الكبار6. بشكل ملحوظ، يمكن أن تكون إعادة تنشيط استجابة للعضلات يجرح وتفرق في خلايا العضلات جديدة لإصلاح العضلات التالفة7.
خصائص الخلية الجذعية جعل دراسة الطوائف المنبوذة ذات الصلة للبيولوجيا العضلات الأساسية والعلاج من أمراض العضلات8. نتيجة لذلك كان مجالاً لتحقيقات مكثفة في العقود الماضية. أحرز تقدم هائل في تشريح علم الوراثة والتخلق من الطوائف المنبوذة9،10. التقنيات المستخدمة في عزل وتحديد الطوائف المنبوذة في الموقع ووضعت والأمثل على طول الطريق11. تلوين إيمونوفلوريسسينت يسمح تحديد اللجان الدائمة من خلال استخدام أجسام مضادة محددة، بما في ذلك Pax7. بيد أن ندرة وصغر حجم الطوائف المنبوذة جنبا إلى جنب مع سيارات-الأسفار قوية من أنسجة العضلات الهيكلية الكبار تقدم التصور الصعبة. وهنا يصف لنا بروتوكولا المصبوغة إيمونوفلوريسسينت الأمثل لانسجة العضلات الماوس ل Pax7، واستنادا إلى أسلوب موجود لالزرد العضلات12. وبالإضافة إلى ذلك، يعمل جسم Laminin المسمى مع فلوروفوري متميزة التعرف على الصفيحة القاعدية التي تقع الطوائف المنبوذة. يسمح هذا البروتوكول استمرار التصور من الطوائف المنبوذة Pax7 الإيجابية والسلائف شذوذ تحت اختبار جميع الظروف الفسيولوجية ومراحل النمو.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول أعلاه يستند إلى أسلوب لتلطيخ Pax7/MF20 في الهيكل العظمى والعضلات الزرد12. الحلول التي تستخدم وعرقلة خطوات مماثلة أو مشابهة. الأجسام المضادة التي تستخدم متطابقة. الخطوات المعدلة التي استندت إلى ميزات أنسجة العضلات الماوس والطوائف المنبوذة. أولاً، تم إضافة جسم لامينين ف…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر “قسم التصوير نيامس الضوء” لتوفير المجاهر والمساعدة التقنية. وتم الحصول على أجسام MF20 و Pax7 من الضفة هيبريدوما الدراسات التنموية المتقدمة تحت إشراف NICHD ويحتفظ بها قسم “العلوم البيولوجية”، جامعة آيوا، مدينة آيوا. وأيد هذا العمل “برنامج البحوث الداخلية من نيامس” من “المعاهد الوطنية للصحة”.
Materials
| methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | |
| 10x PBS | Gibco, Themo Fisher | 70011-044 | |
| 16% PFA | TED PELLA | 50-00-0 | |
| Triton-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher | 0 1-6201 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-007-003 | |
| 20x Citrate Buffer | Thermo Fisher | 00 500 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| Laminin polyclonal rabbit antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| MF20 mono-clonal mouse antibody (IgG2b) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-21121 | |
| Goat anti-Mouse IgG2b cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21242 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Fisher | A32732 | |
| Leica CM1860 cryostat | |||
| Leica DM6000 wide-field fluorescent microscope | |||
| Leica DMR wide-field fluorescent microscope | |||
| Zeiss LSM510 confocal microscope | |||
| Zeiss LSM780 confocal microscope | |||
| Cuisinart electronic pressure cooker |
References
- Buckingham, M. Gene regulatory networks and cell lineages that underlie the formation of skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (23), 5830-5837 (2017).
- Buckingham, M., Relaix, F. PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis. Semin Cell Dev Biol. 44, 115-125 (2015).
- Relaix, F., Buckingham, M. From insect eye to vertebrate muscle: redeployment of a regulatory network. Genes Dev. 13 (24), 3171-3178 (1999).
- Chang, N. C., Chevalier, F. P., Rudnicki, M. A. Satellite Cells in Muscular Dystrophy – Lost in Polarity. Trends Mol Med. 22 (6), 479-496 (2016).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
- Kuang, S., Rudnicki, M. A. The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential. Trends Mol Med. 14 (2), 82-91 (2008).
- Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Satellite cells, the engines of muscle repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (2), 127-133 (2011).
- Rinaldi, F., Perlingeiro, R. C. Stem cells for skeletal muscle regeneration: therapeutic potential and roadblocks. Transl Res. 163 (4), 409-417 (2014).
- Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis. Curr Opin Cell Biol. 19 (6), 628-633 (2007).
- Giordani, L., Puri, P. L. Epigenetic control of skeletal muscle regeneration: Integrating genetic determinants and environmental changes. FEBS J. 280 (17), 4014-4025 (2013).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Feng, X., Adiarte, E. G., Devoto, S. H. Hedgehog acts directly on the zebrafish dermomyotome to promote myogenic differentiation. Dev Biol. 300 (2), 736-746 (2006).
- Juan, A. H., et al. Polycomb EZH2 controls self-renewal and safeguards the transcriptional identity of skeletal muscle stem cells. Genes Dev. 25 (8), 789-794 (2011).
- Jackson, K. A., Snyder, D. S., Goodell, M. A. Skeletal muscle fiber-specific green autofluorescence: potential for stem cell engraftment artifacts. Stem Cells. 22 (2), 180-187 (2004).
- Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements. Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).
