Imagem de Intravital dois fotões de leucócitos durante a resposta imune em fígado de rato lipopolissacarídeo-tratados
Summary
Estabelecemos um protocolo cirúrgico romance para a imagem latente de dois fotões de fígado de ratos ao vivo com invasão mínima. Com esta técnica, identificamos a estrutura detalhada do fígado durante endotoxemia induzidas pelo lipopolissacarídeo. Nós antecipamos que este método pode ser utilizado para determinar a eficácia de vários tratamentos de reagentes para migração de leucócitos hepática.
Abstract
Sepse é um tipo de infecção grave que pode causar a falha de órgãos e tecidos danos. Embora as taxas de mortalidade e morbidade associada com sepse são extremamente elevado, não direto tratamento ou órgãos relacionados com o mecanismo foi examinado em detalhes em tempo real. O fígado é o órgão chave que gerencia as toxinas e infecções no corpo humano. Neste documento, tivemos como objetivo realizar intravital imagem latente do fígado de rato após indução de endotoxemia para acompanhar a motilidade das células do sistema imunológico, tais como neutrófilos e macrófagos capsulares hepáticas (LCMs). Nesse sentido, nós projetamos um novo método cirúrgico para exposição do fígado com cirurgia minimamente invasiva. Os ratos foram injetados intraperitonealmente com lipopolissacarídeo (LPS), um endotoxina comum. Usando nossa nova abordagem cirúrgica para exposição e intravital imagem do recrutamento rato fígado, que encontramos o neutrófilo em proteína de LPS-tratados LysM-verde fluorescente (GFP) fígado de rato foi aumentado em comparação com isso em tampão fosfato fígado de tratados com solução salina. Após o tratamento de LPS, o número de neutrófilos aumentou significativamente com o tempo. Além disso, estamos com êxito usando ratos CX3Cr1-GFP, visualizado fígados macrófagos residentes chamados LCMs. Portanto, para investigar a eficácia de novos reagentes para controlar a mobilidade imune na vivo, determinando a motilidade e morfologia dos neutrófilos e LCMs no fígado pode permitem identificar efeito terapêutico no órgão falha e tecido danos causados por ativação de leucócitos na sepse.
Introduction
O fígado é o órgão metabólico importante nos mamíferos; Ele atua como uma torre de controle para desintoxicação, hormônios e energia1. Devido à sua importância, os pesquisadores realizaram muitos experimentos in vitro e in vivo para elucidar as alterações no fígado durante a inflamação. A microscopia intravital tem sido usada para capturar imagens ao vivo do fígado2 . Com efeito, fígado de vários métodos de imagem têm sido introduzidos2,3,4,5,6. No entanto, a fim de desenvolver uma abordagem cirúrgica mais simplificada e estabilização do órgão-alvo e as células do sistema imunológico, nós projetamos um protocolo simples que pode orientar pesquisadores para minimizar o seu esforço para a imagem latente intravital.
Neste estudo, introduzimos uma câmara de imagem estável e romance e uma técnica cirúrgica que pode ser usada para minimizar o sangramento e possível infecções. Confirmamos que o fígado permaneceu intacto por mais de 2 h. Com este método, identificamos com êxito morfologias de LCMs7 e neutrófilos sob condição séptica. Desde que esse método minimiza fatores confundimento, físicos e biológicos, tais como inflamação trêmula e inesperada durante o procedimento cirúrgico, prevemos que este método pode ser usado para observar reações agudas de células imunes no fígado em resposta a reagentes como LPS.
Protocol
Representative Results
Discussion
O fígado tem sido ativamente estudado por muitos grupos3,10, devido à importância da sua função. Por exemplo, Heymann et al sugeriram um método delicado usando agarose. Embora esse método foi encontrado para ser altamente precisos, a configuração de agarose leva tempo. Todavia, com nossa metodologia, todos os procedimentos podem ser efectuados dentro de 30 min, minimizando outros fatores de confundimento. Em segundo lugar, estabilizar o fígado é extrem…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi suportado por um fundo de nacional pesquisa Fundação de Coreia (NRF) financiado pelo governo da Coreia (MSIP; concessão n. º 2016R1A2B4008199, Y-m. H.) e o Ministério da saúde & bem-estar, República da Coreia (número de concessão: HI14C1324).
Materials
| Custom designed chamber | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Metal cover slide | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Cover glass | Electron Microscopy Sciences | #72204-03 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Erlenmeyer flask | DURAN | 21 216 36 | |
| Cell culture plate (Flat type) | HYUNDAI Micro Co. | H31006 | |
| Desiccator | ADARSH | 55204 | |
| High Q BOND SE 5 mL | BJM LAB | To make semi-permanent dam | |
| Flexible Silicone Rubber Heaters | Omega | SRFR/SRFG SERIES, M1250/0800 | |
| DC power supply | Toyotech | DP30-03A | |
| Phosphate-buffered saline | Home-made | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Salmonella enteria serotype enteritidis | Sigma-Aldrich | L6011 | |
| Texas Red Dextran | Thermo Fisher Scientific | D1830 | |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tube |
FALCON | 14-959-49B | |
| 0.45 μm filter (Minisart Syringe Filter) | Sartorius | 16555k | |
| 1.5ml Micro Tube, Amber | Axygen | MCT-150-X | For light-blocking |
| 1 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S01 | |
| 3 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S03 | |
| 10 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S10 | |
| 0.3 mL insulin syringe | Becton Dickinson | 324900 | |
| Hair removal cream 100 mL | Body natur | ||
| Cotton swab | ABDI | ||
| Zoletil 50 5 mL | Virbac | ||
| Rompun 10 mL | Bayer | ||
| Heating plate | Live Cell Instruments | PH-S-10 | Custom-designed size |
| DC controller | Live Cell Instruments | CU-301 | |
| Microdessection Scissors | Harvard Apparatus | 72-5418 | |
| Scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Forceps | Roboz | RS-5137 | |
| Vet bond | 3M | 1469SB | |
| ZEN software (Black Edition) | Carl Zeiss | Program for LSM 7 MP | |
| LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Volocity | PerkinElmer | Analysis program |
References
- Girard, J. R., et al. Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat. J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. J Vis Exp. (101), e52303 (2015).
- Honda, M., et al. Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice. Transplantation. 95 (4), 551-558 (2013).
- Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PLoS One. 6 (9), e25109 (2011).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145 (2012).
- Sierro, F., et al. A Liver Capsular Network of Monocyte-Derived Macrophages Restricts Hepatic Dissemination of Intraperitoneal Bacteria by Neutrophil Recruitment. Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), (2015).
