Een Optogenetic methode te controleren en analyseren van gen expressiepatronen in cel-naar-cel interacties
Summary
Hier presenteren we een protocol te analyseren van cel naar cel overdracht van oscillerende informatie door optogenetic control en live monitoring van genexpressie. Deze aanpak biedt een uniek platform om te testen een functionele betekenis van dynamische gen expressie programma’s in meercellige systemen.
Abstract
Cellen moeten goed reageren op stoffelijk veranderende omgevingen, die worden beïnvloed door verschillende factoren uit de omliggende cellen. De inkeping signalering traject behoort tot deze essentiële moleculaire machines voor cel-naar-cel communicatie, die spelen een belangrijke rol in de normale ontwikkeling van embryo’s speelt. Dit traject omvat een cel-naar-cel overdracht van oscillerende informatie met ultradian ritmes, maar ondanks de vooruitgang in moleculaire biologietechnieken, heeft het ophelderen van de impact van meercellige interacties op oscillerende gen is uitdagend dynamiek. Hier presenteren we een protocol waarmee optogenetic controle en live gen expressiepatronen in een nauwkeurige temporele manier. Deze methode met succes gebleken dat intracellulaire en intercellulaire periodieke ingangen van de inkeping signalering later intrinsieke oscillaties door frequentie afstemming en faseverschuiving bij de eencellige resolutie. Deze benadering is van toepassing op de analyse van de dynamische functies van verschillende signaalroutes, bieden een uniek platform om te testen een functionele betekenis van dynamische gen expressie programma’s in meercellige systemen.
Introduction
Cel-naar-cel communicatie speelt een belangrijke rol in embryonale patronen in ontwikkelings processen. Bij gewervelde embryo’s, de metameric structuren genaamd somieten langs de as van het anterior-posterior lichaam gevormd met een precieze temporele nauwkeurigheid onder de controle van een tijd-keeping klok, genaamd de segmentatie klok1. Tijdens dit proces, een groep presomitic mesoderm (PSM) cellen worden periodiek omgezet somieten op synchrone wijze. Dit proces omvat gesynchroniseerde oscillerende genexpressie en PSM cellen die in fase oscilleren vormen de dezelfde somieten. De periode van de oscillerende genexpressie is ongeveer 2 tot 3 h in muizen en ongeveer 30 min in zebrafish. Wanneer losgekoppeld, PSM cellen verliezen de synchrony2,3, maar wanneer ze opnieuw geaggregeerde, ze kunnen zelf organiseren en herstellen van de bevolking synchrony4, suggereert dat cel koppeling een sleutel voor de gesynchroniseerde is oscillaties.
Uitgebreide inspanningen bleek dat de signalering moleculen in de Delta-Notch pathway strak met de gesynchroniseerde oscillaties van de segmentatie klok genen verbonden bent. Farmacologische remmers of genetische mutaties van Inkeping signalering desynchronize de bevolking van de oscillatoren. Mutanten van Inkeping signalering van onderdelen, zoals DeltaC, DeltaD en Notch1a, weergeven in zebrafish, asynchrone oscillaties5,6. In chick of muis embryo’s is niet alleen de inkeping ligand Delta-like1 (Dll1), maar ook de inkeping Modulator waanzinnige rand (Lfng) vereist voor gesynchroniseerde oscillaties7,8,9. Echter, het moeilijk geweest om te testen het functionele vermogen van dergelijke moleculen voor dynamische informatieoverdracht van cel naar cel, omdat tijdelijke resoluties van conventionele perturbation van gene verordening dynamiek waren niet voldoende om te onderzoeken de processen van tijdschalen van 2 – 3 h (ultradian ritmes).
Onlangs hebben wij een geïntegreerde methode voor controle en monitor gen expressiepatronen in zoogdiercellen10ontwikkeld. Deze technologie maakt inductie van gen expressie pulsen door periodieke lichte verlichting op ultradian tijdschalen. Dit protocol vertegenwoordigt de methoden lichtgevoelige cel-lijnen te observeren dynamische reacties van verslaggever cellen door live-cel luminescentie toezicht in de context van cel naar cel communicatie. Deze methode is van toepassing op de analyse van vele andere signaalroutes.
Protocol
Representative Results
Discussion
We toonden een methode wilt besturen van gen expressie dynamiek met een frequentie van 2 tot en met 3 h. Deze tijdsschaal is veel korter dan die in andere conventionele systemen, met inbegrip van het Tet-On systeem en de oorspronkelijke LightOn-systeem. Sleutelparameters te bereiken de ultradian termijnen zijn half-leven van foto-geïnduceerde moleculaire producten, mRNAs en eiwitten. Deze kinetische parameters kunnen afhangen van celtypen en soorten. Voor het afstemmen van de kinetiek, is ter vervanging van Hes1 3′ UTR …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door JST, PRESTO (A.I.), Core Research voor evolutionaire wetenschap en technologie (JPMJCR12W2 (R.K.)), Grant-in-Aid voor wetenschappelijkonderzoek op innovatieve gebieden (Ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie (MEXT), Japan 26119708 (A.I.) en 16 H 06480 (R.K.)), wetenschappelijk onderzoek (A) (Japan Society voor de bevordering van de wetenschap (JSPS) 24240049 (R.K.)), en jonge wetenschappers (A) (JSPS 15 H 05326 (A.I.)), en een Grant-in-Aid voor wetenschappelijk onderzoek op innovatieve gebieden “fluorescentie Live imaging”van de MEXT, Japan en Platform voor een dynamische aanpak leven systeem van de MEXT, Japan.
Materials
| FACS | Becton, Dickinson and Company | FACSAriaII SORP | |
| Camera | Andor | iKon M-934 | |
| Microscope | Olympus | IX-81 ZDC | |
| PMT device | Churitsu eletric corp. | CL24B-LIC/B | |
| Blue LED illuminator | OptoCode | LEDB-SBOXH | |
| DMEM | Nacalai | 08459-35 | |
| Penicillin-streptomycin | Nacalai | 26253-84 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | 172012 | |
| KRYSTAL24 (black 24 well plate ) | Hi-tech | 303012 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Nacalai | 20028-24 | |
| Light meter | LI-COR Biosciences | LI-250A | |
| anti-HA-Peroxidase antibody | Roche | clone 3F10 | |
| anti-Actin-Peroxidase antibody | Wako | clone 2F3 |
References
- Hubaud, A., Pourquie, O. Signalling dynamics in vertebrate segmentation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 709-721 (2014).
- Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquié, O. Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact. Int. J. Dev. Biol. 49, 309-315 (2005).
- Masamizu, Y., Ohtsuka, T., Takashima, Y., Nagahara, H., Takenaka, Y., Yoshikawa, K., Okamura, H., Kageyama, R. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cell. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 1313-1318 (2006).
- Tsiairis, C., Aulehla, A. Self-Organization of Embryonic Genetic Oscillators into Spatiotemporal Wave Patterns. Cell. 164, 656-667 (2016).
- Jiang, Y. J., Aerne, B. L., Smithers, L., Haddon, C., Ish-Horowicz, D., Lewis, J. Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock. Nature. 408, 475-479 (2000).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-cell-resolution imaging of the impact of Notch signaling and mitosis on segmentation clock dynamics. Dev. Cell. 23, 995-1005 (2012).
- Dale, J. K., Maroto, M., Dequeant, M. L., Malapert, P., McGrew, M., Pourquié, O. Periodic inhibition by Lunatic Fringe underlies the chick Segmentation Clock. Nature. 421, 275-278 (2003).
- Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling. Nat. Commun. 3, 1141 (2012).
- Shimojo, H., Isomura, A., Ohtsuka, T., Kori, H., Miyachi, H., Kageyama, R. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes Dev. 30, 102-116 (2016).
- Isomura, A., Ogushi, F., Kori, H., Kageyama, R. Optogenetic perturbation and bioluminescence imaging to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information. Genes Dev. 31, 524-535 (2017).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat. Meth. 9, 266-269 (2012).
- Imayoshi, I., Isomura, A., Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T. K., Ishidate, F., Kageyama, R. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, S7 (2007).
- Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy. BMC Biotechnology. 10, 3 (2010).
- Filonov, G. S., Piatkevich, K. D., Ting, L. -. M., Zhang, J., Kim, K., Verkhusha, V. V. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat. Biotechnol. 29, 757-761 (2011).
- Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. The onset of collective behavior in social amoebae. Science. 328, 1021-1025 (2010).
- Kellogg, R. A., Tay, S. Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs. Cell. 160, 381-392 (2015).
