교 잡의 적응 포유류 세포 단백질 Chromatin 관련 단백질의 캡처
Summary
이것은 후속 proteomic 분석에 대 한 가교 된 chromatin의 순서 특정 캡처에 의존 하는 특정 대상 loci에 새로운 상호 작용 하는 DNA 단백질을 식별 하는 방법. 잠재적인 바인딩 단백질도 세포 수정에 대 한 사전 지식이 요구 된다. 처음에 효 모에 대 한 개발, 기술은 지금 되었습니다 포유류 세포에 대 한 적응.
Abstract
단백질 (HyCCAPP) 기술에 대 한 단백질 chromatin 관련의 교 잡 캡처 효 모에 소설 DNA 단백질 상호 작용을 밝히기 위해 처음 개발 되었다. 분석을 대상 지역에 바인딩된 가능성이 단백질에 대 한 사전 지식 없이도 관심의 대상 영역을 수 있습니다. 이론에서 그러면 관심, 어떤 게놈 영역을 분석 하는 데 사용할 HyCCAPP 그리고 다른 세포 시스템에서 작동 하도록 충분 한 유연성을 제공 합니다. 이 방법은 알려진된 전사 인자, Chromatin Immunoprecipitation (칩) 및 칩 같은 방법에 대 한 더 적합 한 작업의 바인딩 사이트를 공부 하는 것은 아닙니다. HyCCAPP의 힘은 제한 된 DNA 영역을 탐구 하는 능력 또는 그것에 바인딩 단백질에 대 한 지식에 있다. 그것은 편견 (칩 같은 방법에 존재 하는) 단백질 기반 chromatin 농축 항 체를 사용 하 여 도입을 방지 하는 편리한 방법을 수 있습니다. 잠재적으로, HyCCAPP를 진정으로 새로운 DNA 단백질 상호 작용을 밝히기 위해 강력한 도구를 수 있습니다. 날짜 하려면, 기술은 주로 적용 된 효 모 세포 또는 포유류 세포에서 높은 복사 반복 시퀀스. 우리가 구상 하는 강력한 도구가 되었다, HyCCAPP 접근 포유류 세포에서 단일 복사 loci를 효율적으로 캡처를 최적화 해야 합니다. 여기, 선물이 우리의 적응 초기 효 HyCCAPP 프로토콜 인간의 세포 라인을 캡처하고 표시 단일 복사 chromatin 지역이 수정 프로토콜 효율적으로 격리 될 수 있습니다.
Introduction
지난 10 년 동안 많은 수의 샘플, 그리고 놀라운 해상도 다양 한 게놈의 연구를 수 있도록 시퀀싱 기술에 극적인 개선을 보았다. 백과 사전의 DNA 요소 (인코딩) 컨소시엄, 국가 인간 게놈 연구소는 건강의 국가 학회의 주도로 대규모 다 기관 노력 개별 녹음 방송 요인에 대 한 통찰력을 제공 하고있다 그리고 다른 규제 단백질 바인딩할 게놈 상호 작용. 초기 노력 Chromatin immunoprecipitation (칩)에 의해 100 개 이상의 알려진된 DNA 묶는 단백질1에 대 한 평가 특정 DNA 단백질 상호 작용, 특징. 등 DNase 프린팅2 포름알데히드 규제 요소 (시 키)3 의 보조 절연 단백질, 하지만 분명 한 제한으로 작용 하는 게놈의 특정 영역을 찾을 사용 되었습니다 또한 다른 방법에 실험 방법 팬 들은 상호 작용 단백질의 정보를 식별 하지 않습니다. 지난 년 동안 광범위 한 노력에도 불구 하 고 아무 기술 염색 질, 그리고 식별에 단백질 DNA 상호 작용의 포괄적인 특성화 및 정량화 chromatin 관련 단백질의 효율적으로 있도록 떠오르고 있다.
이 필요를 해결 하기 위해 우리는 우리가 Hybridization Capture of Chromatin-Associated 단백질으로 단백질 (HyCCAPP)에 대 한 불리는 새로운 접근 방식을 개발. 처음 개발 된 효 모4,5,6, 접근 가교 된 chromatin 관심 영역 (바인딩된 단백질)와 시퀀스 관련 교 잡 캡처를 사용 하 여 격리 합니다. 단백질-DNA 복합물의 고립, 후 질량 분석 등 접근 관심사의 순서에 바인딩된 단백질의 세트의 특성을 사용할 수 있습니다. 따라서, HyCCAPP 소설 DNA 단백질 상호 작용의 항 체 그리고 그것에 의존 하지 않습니다 의미를 밝히기 위해 바이어스 비 접근은 완전히 찾을 수 있는 단백질에 대 한 불가 지론으로 간주 될 수 있습니다. 다른 방법을 밝히기 소설 DNA 상호 작용 단백질7, 하지만 대부분 칩 같은 방법8,,910, 플라스 미드 삽입11,12,에 의존 하는 능력 13,14또는 높은 복사 번호15지역. 반면, HyCCAPP는 다중 및 단일 복사 영역에 적용할 수 있는 그리고 지역에서 단백질에 대 한 사전 정보는 필요 하지 않습니다. 또한, 일부 방법 중 위는 중요 한 기능, 특히 DNA-단백질 가교 반응, HyCCAPP의 독특한 특징은에 단일 복사 영역에 적용할 수 있습니다 필요를 피하고 수정 되지 않은 셀, 언급 하 고 없이 상 상속 의무적인 단백질, 또는 사용할 수 있는 항 체에 대 한 사전 지식.
이 시점에서, HyCCAPP 효 모4,,56, 다양 한 게놈 지역 분석에 주로 적용 되 고 최근 알파 위성 DNA 반복 영역에에서 단백질 DNA 상호 작용을 분석 하는 데 사용 했다 인간 게놈16. 우리의 지속적인 작업의 일환으로, 우리 처음 효 모 chromatin 인간 세포의 분석에 적용 되 고 현재 여기 단일 복사 대상의 선택적 캡처 수 있도록 수정 된 프로토콜에 대 한 개발 교 잡 캡처 접근을 적응 시켰다 우리의 초기 연구에서 효 모와 유사한 효율성으로 인간 게놈에 있는 영역입니다. 이 새로운 최적화 된 프로토콜 적응 및 질량 분석 또는 다른 분석 접근을 사용 하 여 인간 게놈 전체 DNA 단백질 상호 작용을 심문 기술의 활용 수 있습니다.
그것은 HyCCAPP 메서드를 사용 하면 특정 대상 지역 분석을 위한 게놈 넓은 분석에 적합 하지 않습니다 강조 하는 것이 중요. 기술 영역 상호 작용 단백질에 대 한 부족 한 정보는 거래 할 때 또는 특정 게놈 소재 시에 상호 작용 단백질의 더 포괄적인 심층 분석을 원할 때 특히 유용 하다. HyCCAPP은 DNA 묶는 단백질을 폭로 하지만 정확 하 게 genomic DNA에 특정 단백질 바인딩 사이트 특성을 하지 의미입니다. 현재 구현, 방법론 DNA 바인딩 시퀀스 또는 개별 단백질에 대 한 주제에 대 한 정보를 제공 하지 않습니다. 따라서, 그것은 멋지게 시 키, 같은 기존 기술을 보완 하 고 게놈 지역에 소설 묶는 단백질의 id는 초기 시 키 분석으로 식별 하는 것을 허용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 설명 하는 HyCCAPP 메서드는 그것에 게 밝히기 애매 남아 것 이다 DNA 상호 작용 하는 강력한 접근 방식을 많은 독특한 기능이 있습니다. 과정의 성격 HyCCAPP 다른 유기 체와 게놈의 지역에서 작동 하도록 유연성을 제공 합니다. 그러나 그것은 방법,, 그는 몇 가지 제한이 간주.
HyCCAPP 일차 전지, 세포 배양 시스템, 또는 심지어 조직 샘플에서 잠재적으로 적용할 수 있도록 셀 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품 NIH 교부 금 P50HG004952와 모에 R01GM109099에 의해 지원 되었다
Materials
| PrimerQuest tool | IDT | ||
| OligoAnalyzer 3.1 | IDT | Analyze capture oligonucleotids | |
| PairFold | UBC | Analyze interactions | |
| RPMI 1640 media | Thermo Fisher | 11875093 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 26140079 | |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher | ||
| 850 cm2 roller bottle | Greiner Bio-one | 680058 | |
| Roller system | Wheaton | 22-288-525 | |
| 37 % formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | ||
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P4380 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
| Branson digital sonifier SFX 150 | Emerson | ||
| Qubit 3.0 fluorometer | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA BR assay kit | Thermo Fisher | Q32850 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | ||
| Agilent DNA 1000 kit | Agilent | 5067-1504 | |
| MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| NaCl 5M | Thermo Fisher | AM9760G | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| DynaMag-15 magnet | Thermo Fisher | 12301D | |
| Dynabeads M-280 atreptavidin | Thermo Fisher | 60210 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| Hybridization oven | SciGene | ||
| Tube shaker and rotator | Thermo Fisher | 415110Q | |
| DNase I (RNase-free) | New England BioLabs | M0303 | |
| SSC buffer 20× concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 |
References
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