تجزئة للقرار من الأنواع هونتينجتين القابلة للذوبان وغير قابلة للذوبان
Summary
يتم وصف أسلوب لتجزئة الأنواع هونتينجتين متحولة قابلة للذوبان وغير قابلة للذوبان من الماوس المخ والخلية والثقافة. الطريقة الموصوفة مفيدة للتوصيف والتحديد الكمي للتمويه البروتين هونتينجتين والإيدز في تحليل البروتين التوازن في منشأ المرض ووجود اضطرابات
Abstract
تراكم البروتينات تجمعات المركزية لعلم الأمراض في مرض هنتنغتون (HD) والعديد من اضطرابات الأعصاب الأخرى. على وجه التحديد، من السمات مرضية رئيسية هد الشاذة تراكم متحولة HTT (مت) البروتين في مجمعات عالية الوزن الجزيئي وداخل الخلايا إدراج هيئات مؤلفة من شظايا وغيرها من البروتينات. الأساليب التقليدية قياس وفهم وتشمل المساهمات المقدمة من مختلف أشكال المجاميع المحتوية على مت fluorescence مجهرية وتحليل لطخة غربية، وتصفية فخ فحوصات.
بيد أن معظم هذه الطرق هي تكيف محددة ولذلك قد لا تحل الدولة كامل مت البروتين التمويه نظراً للطبيعة المعقدة للذوبان الكلي والقرار.
لتحديد هوية مهتت مجمعة ومختلف أشكال معدلة والمجمعات، الانفصال و solubilization المجاميع الخلوية وشظايا إلزامي. هنا يصف لنا طريقة لعزل وتصور مهتت القابلة للذوبان، مونومرات، ليغومرات، والشظايا، وتراكم وزن الجزيئي عالية غير قابلة للذوبان (همو) الأنواع مهتت. مت حمو المسارات مع تطور المرض، يتوافق مع قراءات سلوك الماوس، وقد تم الاندماج عن طريق التضمين بعض التدخلات العلاجية1. هذا النهج يمكن استخدامها مع الماوس المخ والأنسجة المحيطية، وثقافة الخلية ولكن يمكن أن تتكيف مع نظم نموذجية أو المرض السياقات الأخرى.
Introduction
تعطيل شبكات مراقبة جودة البروتين التي تكفل طي السليم وتدهور البروتينات الخلوية هو الوسطى المرجح لعلم الأمراض في مرض الزهايمر (AD)، ومرض باركنسون (PD)، مرض هنتنغتون (HD)، والأخرى “ميسفولدينج البروتين” اضطرابات2،3. ولذلك فهم مفصل لمكونات شبكة الاتصال بروتيوستاسيس ومساهماتها في علم الأمراض تعتبر حاسمة لتطوير تحسين التدخلات العلاجية. بسبب التوسع الشاذة من تكرار كاج داخل الجينات هد نتج عنه امتداد موسعة من بوليجلوتامينيس (polyQ) في هونتينجتين (HTT) البروتين4HD. ميزة مرضية متسقة في إمراضية عالية الدقة هو ميسفولدينج الناجمة عن ذلك، التراكم، وتجميع HTT في مناطق الدماغ والأنسجة المحيطية، التي أظهرت أن تتدخل في عدة طرق التوازن الخلية الطبيعية ووظيفة 5 , 6. HTT حين يتم التعبير عن أوبيكويتوسلي، والخلايا العصبية شوكي متوسطة في المخطط انتقائية الضعيفة والمتأثرة الأكثر صراحة مع ضمور القشرية الجديرة بالذكر أيضا المرتبطة بهد المرضية.
عادة خدمت تشكيل مجاميع HTT في الدماغ للمرضى عالية الدقة ونماذج حيوانية كعلامة وكيل لتطور المرض والسلبية المهيمنة للحصول على وظيفة مت7. على الرغم من أن آليات دقيقة من البروتين التي ميسفولدينج والتجميع قد تسهم السمية التي يسببها مت لا تزال غير واضحة، تشكيل هذه الإدراجات في الدماغ المرضى عالية الدقة ومختلف نماذج حيوانية سمة ثابتة ولا مفر منه. تضمينات تظهر أن تتألف إلى حد كبير من الشظايا HTT المتراكمة التي تحتوي على N–المحطة الطرفية توسيع polyQ، مشيراً إلى أن بروتيوليسيس وتجهيز كامل طول HTT فضلا عن بديل ذو8،وقد لعب9 قد تشكل دوراً هاما في الآلية المرضية للشظايا HTT ن hd.–المحطة الطرفية شكل باثولوجي HTT التي يمكن تجميع سريعاً، نوكلياتي، والتعجيل أو نشر عملية تجميع10.
ومع ذلك، وجود هذه تضمينات لا يرتبط بالضرورة مع السمية التي يسببها HTT أو خلية الموت11. واقترح للخضوع لعملية تجميع من مركب قابل لذوبان من خلال الأنواع القابلة للذوبان أوليجوميريك وييفات β-ورقة للمجاميع غير قابلة للذوبان وتضمينات12HTT. وقد حل هذه الأنواع المختلفة من البروتين عن طريق فحوصات الكيمياء الحيوية القياسية تحديا في الميدان نظراً لاستقرارها في المخزن المؤقت لتحلل منخفضة-المنظفات وصعوبة في تصور استخدام الاختبارات البيوكيميائية القياسية. وهكذا، الاعتبارات المنهجية الحاسمة في الكشف عن درجة ونمط مت المتراكمة ومجمعة.
وينص البروتوكول على المقدمة هنا طريقة لتصور وسيطة العديد من HTT، على وجه التحديد تشكيل أنواع HTT حمو تستعصي على الحل الذي يظهر لتتبع عن كثب مع هد المرضية والأمراض التقدم1،13 ،14. التمكن من حل وتتبع الأنواع المتعددة من مت يوفر الباحثين أداة بيوكيميائية دراسة منشأ المرض وتقييم التدخلات العلاجية المحتملة عن طريق التحوير وأثر على منشأ المرض.
Protocol
Representative Results
Discussion
بعض الاحتياطات اللازمة للبروتوكولات المذكورة أعلاه لضمان تحقيق نتائج متسقة والكمية. أولاً، مت في كلا كسور عفوية ستشكل المجاميع مع مرور الوقت على عدة دورات ذوبان التجميد، لا سيما عندما تكون في تركيزات عالية. وبالتالي من الضروري تجميد مختبرين محضرات البروتين، وذوبان الجليد فقط حجم اللازم?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة (RO1-NS090390). ونود أيضا أن نشكر الدكتور جوان ستيفانفور المساعدة التقنية والمناقشة أثناء وضع هذا التحليل.
Materials
| Sterile Filter | Millipore | SCGP505RE | Screw cap, sterile vaccum filter |
| 1 mL Tissue Grinder, Dounce | Wheaton | 357538 | |
| Sonicator | Qsonica | Model Q125 | |
| DC Protein Assay | Biorad | 5000111 | Comparable to Lowry assay |
| Tris 1M buffer solution | Alfa Aesar | J60636 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| NaCl 5M solution | Teknova | S0251 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| 20% SDS solution | Teknova | S0295 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E1271 | |
| Phenylmethylsulfony flouride | Sigma | P7626 | create 100mM stock solution in 100%EtOH, store at 4°C |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | Create 0.5M stock solution in water |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Sodium Fluoride | Sigma | S4504 | Create 500mM stock solution in water |
| Anti-HTT | Millipore | MAB5492 | Use 1:1000 for western blot, 1:500 for filter retardation assay |
| Anti-GAPDH | Novus Biologicals | NB100-56875 | Use 1:1000 for soluble western blot |
References
- Ochaba, J., et al. PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington’s Disease-Associated Phenotypes In Vivo. Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).
- La Spada, A. R., Taylor, J. P. Repeat expansion disease: progress and puzzles in disease pathogenesis. Nat Rev Genet. 11 (4), 247-258 (2010).
- Reiner, A., Dragatsis, I., Dietrich, P. Genetics and neuropathology of Huntington’s disease. Int Rev Neurobiol. 98, 325-372 (2011).
- The Huntington’s Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington’s disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
- Sassone, J., Colciago, C., Cislaghi, G., Silani, V., Ciammola, A. Huntington’s disease: the current state of research with peripheral tissues. Exp Neurol. 219 (2), 385-397 (2009).
- Weydt, P., et al. Thermoregulatory and metabolic defects in Huntington’s disease transgenic mice implicate PGC-1alpha in Huntington’s disease neurodegeneration. Cell Metab. 4 (5), 349-362 (2006).
- Schulte, J., Littleton, J. T. The biological function of the Huntingtin protein and its relevance to Huntington’s Disease pathology. Curr Trends Neurol. 5, 65-78 (2011).
- Gipson, T. A., Neueder, A., Wexler, N. S., Bates, G. P., Housman, D. Aberrantly spliced HTT, a new player in Huntington’s disease pathogenesis. RNA Biol. 10 (11), 1647-1652 (2013).
- Neueder, A., et al. The pathogenic exon 1 HTT protein is produced by incomplete splicing in Huntington’s disease patients. Sci Rep. 7 (1), 1307 (2017).
- Arndt, J. R., Chaibva, M., Legleiter, J. The emerging role of the first 17 amino acids of huntingtin in Huntington’s disease. Biomol Concepts. 6 (1), 33-46 (2015).
- Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D., Greenberg, M. E. Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions. Cell. 95 (1), 55-66 (1998).
- Kim, S., Kim, K. T. Therapeutic Approaches for Inhibition of Protein Aggregation in Huntington’s Disease. Exp Neurobiol. 23 (1), 36-44 (2014).
- O’Rourke, J. G., et al. SUMO-2 and PIAS1 modulate insoluble mutant huntingtin protein accumulation. Cell Rep. 4 (2), 362-375 (2013).
- Shibata, M., et al. Regulation of intracellular accumulation of mutant Huntingtin by Beclin 1. J Biol Chem. 281 (20), 14474-14485 (2006).
- Apostol, B. L., et al. A cell-based assay for aggregation inhibitors as therapeutics of polyglutamine-repeat disease and validation in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5950-5955 (2003).
- Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
- Sontag, E. M., et al. Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules. J Huntingtons Dis. 1 (1), 119-132 (2012).
- Grima, J. C., et al. Mutant Huntingtin Disrupts the Nuclear Pore Complex. Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).
- Sontag, E. M., et al. Methylene blue modulates huntingtin aggregation intermediates and is protective in Huntington’s disease models. J Neurosci. 32 (32), 11109-11119 (2012).
- Trushina, E., Rana, S., McMurray, C. T., Hua, D. H. Tricyclic pyrone compounds prevent aggregation and reverse cellular phenotypes caused by expression of mutant huntingtin protein in striatal neurons. BMC Neurosci. 10, 73 (2009).
- Shahmoradian, S. H., et al. TRiC’s tricks inhibit huntingtin aggregation. Elife. 2, e00710 (2013).
- Kim, Y. M., et al. Proteasome inhibition induces alpha-synuclein SUMOylation and aggregate formation. J Neurol Sci. 307 (1-2), 157-161 (2011).
- Goldberg, N. R. S., et al. Human Neural Progenitor Transplantation Rescues Behavior and Reduces alpha-Synuclein in a Transgenic Model of Dementia with Lewy Bodies. Stem Cells Transl Med. 6 (6), 1477-1490 (2017).
