Fraccionamiento para la resolución de las especies de huntingtina Soluble e Insoluble
Summary
Se describe un método para fraccionamiento de huntingtina mutada insoluble y soluble especies de ratón cerebro y la célula cultura. El método descrito es útil para la caracterización y cuantificación de flujo de la proteína huntingtina y SIDA en el análisis de homeostasis de proteínas en la patogénesis de la enfermedad y en presencia de perturbaciones
Abstract
La acumulación de proteínas mal plegadas es central a la patología en la enfermedad de Huntington (HD) y muchos otros trastornos neurodegenerativos. Específicamente, una característica patológica fundamental de HD es la acumulación aberrante de la proteína del mutante de HTT (mHTT) en complejos de alto peso molecular y los cuerpos de inclusión intracelulares compuesto por fragmentos y otras proteínas. Los métodos convencionales para medir y entender que las contribuciones de las diversas formas de agregados que contienen mHTT incluyen microscopía de fluorescencia, mancha blanca /negra occidental análisis y filtro trampa de ensayos.
Sin embargo, la mayoría de estos métodos es específicos de conformación y por lo tanto no puede resolver el estado completo del flujo de proteína mHTT debido a la naturaleza compleja de solubilidad total y resolución.
Para la identificación de complejos y varias formas modificadas y mHTT agregado, separación y solubilización de los agregados celulares y fragmentos es obligatoria. Aquí se describe un método para aislar y visualizar la mHTT soluble, monómeros, oligómeros, fragmentos y un insoluble alto peso molecular (HMW) acumulado mHTT especies. HMW mHTT pistas con la progresión de la enfermedad corresponde con lecturas de comportamiento del ratón y ha sido beneficioso modulada por determinadas intervenciones terapéuticas1. Este enfoque puede utilizarse con cultivo de células, los tejidos periféricos y cerebro de ratón, pero puede adaptarse a otro modelo de los sistemas o contextos de enfermedad.
Introduction
La interrupción de las redes de control de calidad de proteínas que aseguran el correcto plegamiento y degradación de proteínas celulares son probable central a patología en la enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), enfermedad de Huntington (EH) y otros “proteína mal plegamiento” trastornos de2,3. Una comprensión detallada de los componentes de red proteostasis y sus contribuciones a la patología son cruciales para el desarrollo de intervenciones terapéuticas mejoradas. HD es causado por la anormal extensión de una repetición de CAG en el gen de la EH en un tramo mayor de polyglutamines (poliQ) en la proteína de huntingtina (HTT)4. Una constante característica patológica de la patogenesia de la HD es la resultante mal plegamiento, acumulación y agregación de HTT en regiones del cerebro y en tejidos periféricos, que se ha demostrado que interferir en varios aspectos con la función y la homeostasis celular normal 5 , 6. HTT mientras que ubicuo se expresa, las neuronas espinosas medianas en el estriado son selectivamente vulnerables y más abiertamente afectadas con notable atrofia cortical asociada también a la patogenia de la HD.
La formación de agregados de HTT en el cerebro de pacientes con EH y en modelos animales por lo general ha servido como marcador de progresión de la enfermedad y la ganancia negativa dominante de la función para la mHTT7proxy. Aunque los mecanismos precisos por que la proteína mal plegamiento y agregación pueden contribuir a la toxicidad inducida por la mHTT siguen siendo confusos, la formación de las inclusiones en el cerebro de pacientes con EH y en varios modelos animales es una característica invariable e inevitable. Inclusiones aparecen a conformada en gran parte fragmentos HTT acumuladas que contiene el N-terminal ampliada poliQ, indicando que la proteólisis y de larga duración HTT como alternativa empalme8,9 pueden desempeñar un papel importante en la patogenesia de fragmentos N-terminal HD. HTT puede constituir una forma patológica de HTT que puede agregar rápidamente, nuclear y acelerar o propagar el proceso de agregación10.
Sin embargo, la presencia de estas inclusiones no se correlaciona necesariamente con toxicidad inducida HTT o célula muerte11. HTT se ha propuesto para someterse a un proceso de agregación de un monómero soluble a través de especies oligoméricas solubles y las fibrillas de β-hoja a agregados insolubles y las inclusiones12. Resolver estas diversas especies de proteína mediante análisis bioquímicos estándar ha sido un reto en el campo debido a su estabilidad en tampón de lisis poco detergente y dificultad en visualizar usando análisis bioquímicos estándar. Por lo tanto, consideraciones metodológicas son fundamentales para detectar el grado y patrón de la mHTT acumulada y agregada.
El protocolo presentado aquí ofrece un método para visualizar varios intermedios de HTT, específicamente la formación de una especie de HMW HTT insoluble que parece seguir muy de cerca con HD patogénesis y enfermedad progresión1,13 ,14. Ser capaz de resolver y seguimiento de múltiples especies de mHTT ofrece a los investigadores una herramienta bioquímica para estudiar la patogénesis de la enfermedad y evaluar posibles intervenciones terapéuticas a través de su modulación y su impacto en la patogénesis de la enfermedad.
Protocol
Representative Results
Discussion
Algunas precauciones son necesarias para que los protocolos anteriores asegurar resultados consistentes y cuantitativos. En primer lugar, mHTT en ambas fracciones espontáneamente forman agregados con el tiempo a múltiples ciclos de descongelación de congelación, especialmente cuando en una alta concentración. Por lo tanto es crítico para congelar alícuotas de las preparaciones de proteínas y descongelar sólo el volumen necesario antes de ejecutar el ensayo como se describe en el protocolo anterior. Además, si f…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por los NIH (to1-NS090390). También nos gustaría agradecer al Dr. Joan Steffanfor asistencia técnica y debate durante el desarrollo de este ensayo.
Materials
| Sterile Filter | Millipore | SCGP505RE | Screw cap, sterile vaccum filter |
| 1 mL Tissue Grinder, Dounce | Wheaton | 357538 | |
| Sonicator | Qsonica | Model Q125 | |
| DC Protein Assay | Biorad | 5000111 | Comparable to Lowry assay |
| Tris 1M buffer solution | Alfa Aesar | J60636 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| NaCl 5M solution | Teknova | S0251 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| 20% SDS solution | Teknova | S0295 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E1271 | |
| Phenylmethylsulfony flouride | Sigma | P7626 | create 100mM stock solution in 100%EtOH, store at 4°C |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | Create 0.5M stock solution in water |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Sodium Fluoride | Sigma | S4504 | Create 500mM stock solution in water |
| Anti-HTT | Millipore | MAB5492 | Use 1:1000 for western blot, 1:500 for filter retardation assay |
| Anti-GAPDH | Novus Biologicals | NB100-56875 | Use 1:1000 for soluble western blot |
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