Évaluation de la fonction vésiculaire extracellulaire au cours de l’Infection palustre
Summary
Dans ce travail, nous décrivons les protocoles afin d’étudier le rôle des vésicules extracellulaires (EVs) libéré par les érythrocytes de Plasmodium falciparum infectés. En particulier, nous nous concentrons sur les interactions des véhicules électriques avec des cellules endothéliales.
Abstract
Le paludisme est une maladie mortelle causée par les parasites Plasmodium , à P. falciparum est le plus répandu sur le continent africain et le responsable de la plupart des décès liés au paludisme dans le monde. Plusieurs facteurs, notamment la fixation du parasite dans les tissus, dysfonction vasculaire et les réponses inflammatoires influencent l’évolution de la maladie chez les personnes infectées par le paludisme. P. falciparum-globules rouges infectés (iRBCs) libérer de petites vésicules extracellulaires (EVs) contenant différentes sortes de molécules de cargaison qui médient pathogenèse et cellulaire communication entre l’hôte et de parasites. SVE est efficacement absorbés par les cellules dans lesquelles ils modulent leur fonction. Nous discutons des stratégies pour aborder le rôle des véhicules électriques dans les interactions parasite-hôte. Tout d’abord, nous décrivons une méthode simple pour l’étiquetage et l’internalisation de l’EV de suivi par les cellules endothéliales, à l’aide d’un colorant de linker cellule verte. Deuxièmement, nous rapportons une façon simple de mesurer la perméabilité à travers une monocouche de cellules endothéliales en utilisant un dextran fluorescent étiqueté. Enfin, nous montrons comment enquêter sur le rôle des petites molécules d’ARN non codants en fonction des cellules endothéliales.
Introduction
Selon l’Organisation mondiale de la santé, il y a 212 millions de nouveaux cas de paludisme dans le monde en 2015 et environ 429 000 personnes sont mortes, principalement des enfants moins de cinq ans d’âge1. Les mécanismes conduisant à une maladie grave, qui est souvent associée à une dysfonction vasculaire, restent mal définis2. Plasmodium– iRBCs sécrètent des sphères petit bi-lipides membranaires appelées vésicules extracellulaires (EVs). On sait que ces véhicules électriques sont susceptibles d’être pertinents pour le processus d’infection et de la réponse immunitaire de hôte à l’infection ; Cependant, on connaît la fonction exacte de ces petites vésicules au cours de l’ infection de paludisme3. Il est possible qu’ils jouent deux rôles importants : d’une part, ils pourraient contribuer à la pathogenèse en activant des macrophages4,5; et d’autre part, ils pourraient agir comme médiateur communication cellulaire entre les parasites et entre les parasites et hôte6,7. En fait, parasites peuvent transférer des protéines ou des acides nucléiques entre eux via EVs. Par exemple, Trypanosoma brucei rhodesiense EVs peut transférer le facteur de virulence Serum Resistance-Associated (SRA) et peut également cibler les autres T. brucei et hôte érythrocytes8. En outre, à P. falciparum– iRBCs communiquer entre eux par le transfert d’acides nucléiques dans les véhicules électriques. Cela permet les parasites d’optimiser et de synchroniser sa croissance. En fait, les EVs pourraient être le principal régulateur de la conversion gamétocyte et donc contribuer à la régulation de la transmission Etape7.
Non seulement EVs réglementent les parasites, ils véhiculent aussi des interactions hôte-parasite. Nous avons récemment découvert que EVs d’iRBCs contiennent des dérivés hôte le microARN (miARN ; petites espèces d’ARN dans la fourchette de 21 à 25 nucléotides9) qui était absorbés par les cellules endothéliales humaines. Les miARN du serveur virtuel Exchange forme un complexe avec Ago2 stable (membre de la RNA-induced silencing complex), qui, une fois livré à des cellules réceptrices, est capable de plus précisément faire taire l’expression des gènes et qui affectent les propriétés barrières des cellules10. Protocoles standards ont été développés pour étudier la fonction du SVE. Nous décrivons ici tout d’abord un protocole qui permet le marquage fluorescent de EVs pour enquêter sur leur absorption par les cellules réceptrices. En outre, en utilisant un microscope confocal, il est possible de suivre le sort de l’EV à l’intérieur de la cellule. Plusieurs colorants fluorescents peuvent être utilisés pour suivre les EVs. Le colorant réactif-amine, 5-(and-6)-carboxyfluorescéine diacétate Succinimidyl Ester (CFSE) et fluorescentes de calcéine-AM deviennent une fois à l’intérieur des vésicules. Nous préférons utiliser le label amphiphiles, PKH, parce qu’il donne un signal plus lumineux et plus uniform. Cette approche fournit des informations importantes pour comprendre les interactions entre les véhicules électriques et de cellules réceptrices. Tandis que dans certains cas, EVs se lient à la surface des cellules, des vésicules sont rapidement absorbés. Après absorption, EVs livrent leur cargaison aux cellules, dans lequel ils exercent leurs fonctions de réglementation.
Nous décrivons ici un protocole visant à mesurer la fonction barrière de la cellules endothéliales in vitro en quantifiant le transfert d’un dextran fluorescent à travers une couche cellulaire. Traceurs plus sensibles peuvent être utilisées comme marqueurs radioactifs. Toutefois, dont ils ont besoin de précautions spéciales pour utilisation. Autres tests existent pour mesurer la fonction de barrière en vitro telles que la résistance électrique transendothéliale (TEER), qui mesure l’intégrité de la jonction serrée. Enfin les visualisation ZO-1, une protéine de jonction serrée, par immunofluorescence permet d’évaluer de l’intégrité de la jonction serrée comme bien10. EVs étant des entités complexes et hétérogènes contenant plusieurs cargaisons avec caractéristiques réglementaires potentielles, il est utile de surexprimer un ARN spécifique pour étudier ses effets sur la cellule receveuse. Par conséquent, nous définissons également un protocole qui vise à produire des lignées cellulaires stables exprimant la miRNA d’intérêt10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Plusieurs parasites, notamment Toxoplasma, Trypanosoma, Leishmania et Trichomonas déclenchent la libération des véhicules électriques de la cellule hôte infectée. Selon les agents pathogènes, le SVE libéré peut moduler la réponse immunitaire hôte ou médiation communication cellulaire entre les parasites6. Pourtant, il y a peu de preuves suggérant comment ces petites vésicules contribuent au paludisme. Ici, nous avons décrit plusieurs manières d’étudier la fonction des véhicules…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée en partie par la Fondation Novartis medical – recherche biologique (à PYM), la Gottfried et Julia Bangerter-Rhyner-Stiftung (à MW et PYM) et le bassin de recherche de l’Université de Fribourg (à PYM). Subventions supplémentaires comprennent les bourses d’Excellence gouvernement suisse pour étudiants étrangers (à KAB et SM). Nous remercions Isabelle Fellay et Solange Kharoubi Hess pour le support technique.
Materials
| PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich | G8278 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| PBS | ThermoFisher – Gibco | 10010023 | |
| Phalloidin CF594 | Biotium | #00045 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | ThermoFisher | R9379-250MG | |
| Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells | Falcon | 353095 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | Promocell | C-22020 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit | Biovision | K300-500 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| MISSION Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a | Sigma-Aldrich | HLMIR0583 | |
| MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles | Sigma-Aldrich | NCLMIR001 | |
| MISSION Lenti microRNA, Human | Sigma-Aldrich | NCLMIR0001 | |
| Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| miRNeasy mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions | ThermoFisher | 4366597 | |
| hsa-mir-451a RT/750 PCR rxns | ThermoFisher | 001141 | |
| U6 snRNA | ThermoFisher | 001973 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, with UNG | ThermoFisher | 4440038 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | ThermoFisher | 4376600 |
References
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