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Immunologie et infection

Un protocole Facile à générer des protéines relativement acétylées chez Escherichia Coli

Published: December 09, 2017
doi:
10.3791/57061
, , , ,
1Department of Chemistry and Biochemistry,University of Arkansas, 2Cell and Molecular Biology Program,University of Arkansas, 3Department of Biological Sciences,University of Arkansas, 4Fayetteville High School

Summary

Expansion du code génétique est un outil puissant pour étudier un large éventail de processus biologiques, y compris l’acétylation protéique. Nous démontrons un protocole facile à exploiter cette technique pour générer de façon homogène acétylé de protéines à des sites spécifiques dans les cellules d’Escherichia coli .

Abstract

Les modifications post-traductionnelles qui se produisent à des positions spécifiques des protéines ont démontré que jouent un rôle important dans divers processus cellulaires. Parmi eux, acétylation de la lysine réversible est l’un du plus largement distribué dans tous les domaines de la vie. Bien que de nombreuses études acetylome basé sur la spectrométrie de masse ont été effectuées, outre caractérisation de ces cibles d’acétylation putative a été limitée. Une des raisons est qu’il est difficile de produire des protéines purement acétylées aux positions souhaitées par la plupart des approches biochimiques classiques. Pour relever ce défi, la technique d’expansion de code génétique a été appliquée pour utiliser la paire de variante de machiné pyrrolysyl-tRNA synthétase et son ARNt délivre-t-il des espèces de Methanosarcinaceae , pour diriger l’incorporation présent d’acetyllysine sur le site spécifique de la protéine d’intérêt. Après la première application à l’étude de l’acétylation des histones, cette approche a facilité des études d’acétylation sur une variété de protéines. Dans ce travail, nous avons démontré un protocole facile pour produire des protéines relativement acétylés en utilisant la bactérie modèle Escherichia coli comme hôte. Malate déshydrogénase a été utilisée comme un exemple de démonstration dans cet ouvrage.

Introduction

Les modifications post-traductionnelles des protéines (PTMs) surviennent après le processus de traduction et sont addition covalente de groupes fonctionnels aux résidus d’acides aminés jouant un rôle important dans presque tous les processus biologiques, y compris le gène transcription, réponse au stress, différenciation cellulaire et métabolisme1,2,3. À ce jour, environ 400 distinctif SPTM ont été identifiés4. La complexité du génome et le protéome est amplifiée dans une large mesure par la protéine SPTM, car ils régulent la localisation et l’activité de la protéine et affectent l’interaction avec d’autres molécules comme les protéines, acides nucléiques, lipides et cofacteurs5.

L’acétylation protéique a été à l’avant-garde des études SPTM dans les derniers vingt ans6,7,8,9,10,11,12. Acétylation de la lysine a été découvert en histones il y a plus de 50 ans13,14, a été bien étudié et est connue dans plus de 80 facteurs de transcription, les régulateurs et diverses protéines15, 16,17. Études sur l’acétylation protéique ont non seulement nous a fourni une meilleure compréhension de ses mécanismes de réglementation, mais aussi guidé les traitements pour un certain nombre de maladies causées par l’acétylation dysfonctionnel18,19, 20 , 21 , 22 , 23. on a cru que l’acétylation de la lysine n’arrive que chez les eucaryotes, mais des études récentes ont montré cette acétylation protéique joue également des rôles clés dans la physiologie bactérienne, y compris la chimiotaxie, résistance aux acide, activation et stabilisation de îles de pathogénicité et autre virulence des protéines24,25,26,27,28,29.

Une méthode couramment utilisée pour caractériser biochimiquement acétylation de la lysine est à l’aide de mutagenèse dirigée. Glutamine est utilisée comme un imitateur d’acetyllysine en raison de sa taille et sa polarité similaire. Arginine est utilisé comme un imitateur de lysine acétylée non, car il conserve sa charge positive dans des conditions physiologiques, mais ne peut pas être acétylée. Toutefois, les deux imitateurs ne sont pas des vrais isostères et ne donnent pas toujours les résultats escomptés30. L’approche plus rigoureuse consiste à générer des protéines homogènement acétylées aux résidus de lysine spécifique, qui est difficile, voire impossible, pour des méthodes plus classiques en raison de la faible stoechiométrie d’acétylation de la lysine dans nature7,11. Ce défi a été élucidé par la stratégie d’expansion de code génétique, qui emploie une ingénierie pyrrolysyl-tRNA synthétase variant de Methanosarcinaceae espèces de facturer les ARNtPyl avec acetyllysine, utilise l’hôte translationnelle machines pour réprimer l’UAG arrêtez le codon de l’ARNm et ordonne à l’incorporation d’acetyllysine en position conçue des protéines cibles31. Récemment, nous avons optimisé ce système avec une amélioration de l’EF-Tu-liaison ARNt32 et une mise à niveau acetyllysyl-ARNt synthétase33. En outre, nous avons appliqué ce système amélioré d’incorporation dans les études d’acétylation de malate déshydrogénase34 et tyrosyl-tRNA synthétase35. Ici, nous montrons le protocole pour générer des protéines purement acétylés depuis le clonage moléculaire d’identification biochimique à l’aide de la malate déshydrogénase (MDH), dont nous avons longuement étudié comme un exemple démonstratif.

Protocol

1. mutagenèse du gène cible Note : MDH est exprimée par un promoteur T7 dans le vecteur de pCDF-1 avec l’origine de CloDF13 et un nombre de copies de 20 à 4034. Introduire le codon ambre à la position du gène 140 amorces (avant apprêt : GGTGTTTATGACTAGAACAAACTGTTCGGCG et amorce de marche arrière : GGCTTTTTTCAGCACTTCAGCAGCAATTGC), suivant les instructions de la trousse de mutagenèse dirigée. Amplifier …

Representative Results

Le rendement d’acétylés protéine MDH est 15 mg / culture 1 L, tandis que celle du type sauvage MDH a été 31 mg / culture 1 L. Protéines purifiées ont été analysés par SDS-PAGE, comme illustré à la Figure 1. Le MDH sauvage a été utilisé comme un contrôle positif à34. La protéine purifiée de cellules contenant le système d’intégration acetyllysine (AcK) et le gène mutant mdh , sans accusé de réception…

Discussion

La constitution génétique des acides aminés non canonique (ANAC) est basée sur la répression d’un codon affectée, principalement l’arrêt ambre codon UAG36,37,38,39, de l’ARNt chargé ncAA contenant l’anticodon correspondante. On sait le codon UAG est reconnu par la release factor-1 (RF1) chez les bactéries, et il peut également être supprimée par près de tRNA délivre-t-il d…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par les NIH (AI119813), la mise en marche de l’Université de l’Arkansas et le prix de l’Institut de Biosciences de l’Arkansas.

Materials

Bradford protein assay Bio-Rad 5000006 Protein concentration
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747 SDS sample buffer
Coomassie G-250 Stain Bio-Rad 1610786 SDS-PAGE gel staining
4-20% SDS-PAGE ready gel Bio-Rad 4561093 Protein determination
Ac-K-100 (HRP Conjugate) Cell Signaling 6952 Antibody
IPTG CHEM-IMPEX 194 Expression inducer
Nε-Acetyl-L-lysine CHEM-IMPEX 5364 Noncanonical amino acid
PD-10 desalting column GE Healthcare 17085101 Desalting
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit NEB E0554 Introducing the stop codon
BL21 (DE3) cells NEB C2527 Expressing strain
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN 27106 Extracting plasmids
Ni-NTA resin QIAGEN 30210 Affinity purification resin
nicotinamide Sigma-Aldrich N3376 Deacetylase inhibitor
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250 Reducing agent
BugBuster Protein Extraction Reagent Sigma-Aldrich 70584 Breaking cells
Benzonase nuclease Sigma-Aldrich E1014 DNase
ECL Western Blotting Substrate ThermoFisher 32106 Chemiluminescence
Premixed LB Broth VWR 97064 Cell growth medium
Bovine serum albumin VWR 97061-416 western blots blocking
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References

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Site-specific AcetylationProtein AcetylationGenetic Code ExpansionPyrrolysyl-tRNA SynthetaseAmber Stop CodonE. Coli ExpressionSite-directed MutagenesisAcetyllysine Incorporation

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Citer Cet Article
Venkat, S., Gregory, C., Meng, K., Gan, Q., Fan, C. A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli. J. Vis. Exp. (130), e57061, doi:10.3791/57061 (2017).
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