JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie du développement

Análisis cinético de vasculogénesis cuantifica la dinámica de la vasculogénesis y angiogénesis In Vitro

Published: January 31, 2018
doi:
10.3791/57044
, , ,
1Department of Cellular and Integrative Physiology,Indiana University School of Medicine, 2Herman B Wells Center for Pediatric Research,Indiana University School of Medicine, 3Indiana Center for Biological Microscopy,Indiana University School of Medicine, 4Department of Medicine,Indiana University School of Medicine, 5Department of Pediatrics,Indiana University School of Medicine, 6Department of Microbiology and Immunology,Indiana University School of Medicine, 7Indiana University Simon Cancer Center,Indiana University School of Medicine

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para la proyección de imagen de Time-lapse y fase de análisis de la vasculogénesis en vitro usando microscopía de contraste junto con el software de código abierto, análisis cinético de la vasculogénesis. Este protocolo se puede aplicar para evaluar cuantitativamente el potencial de Vasculogénica de numerosos tipos de células o condiciones experimentales que modelo de enfermedad vascular.

Abstract

Vasculogénesis es un proceso complejo por el cual las células madre y progenitoras endoteliales sufren de novo formación de vasos. Evaluación cuantitativa de la vasculogénesis se ha convertido en una lectura central de la funcionalidad de células progenitoras endoteliales, y por lo tanto, se hicieron varios intentos para mejorar modelos de vasculogénesis tanto in vitro e in vivo . Sin embargo, los métodos estándar son limitados en alcance, con mediciones estáticas no capturar muchos aspectos de este proceso altamente dinámico. Por lo tanto, el objetivo de desarrollar este nuevo protocolo era evaluar la cinética de la vasculogénesis en vitro con el fin de cuantificar las tasas de formación de redes y estabilización, así como proporcionar la penetración en mecanismos potenciales subyacentes vascular disfunción. Aplicación de este protocolo se demuestra utilizando Colonia endotelial fetal formando células (ECFCs) expuestas a diabetes mellitus materna. ECFCs fetales fueron derivados de la sangre del cordón umbilical después del nacimiento, cultivados y plateados en diapositivas que contiene la matriz de la membrana del sótano, donde experimentaron la vasculogénesis. Imágenes de los pozos de la diapositiva entera fueron adquiridas mediante microscopía de contraste de fase Time-lapse durante 15 horas. Imágenes se analizaron para la derivación de datos cuantitativos utilizando un software de análisis llamado análisis cinético de vasculogénesis (KAV). KAV utiliza segmentación seguida skeletonization para analizar los componentes de la red de pilas de imágenes de contraste de fase punto multi-tiempo obtener diez parámetros (9 medidos, 1 calculado) de estructura de red, incluyendo: cerrado redes, áreas de la red, nodos, ramas, longitud total rama, longitud de rama media, nodos ramificados triple, ramificados de cuatro nodos, estructuras de la red y el poder relación nodo. Aplicación de este protocolo identificado altera tarifas de vasculogénesis en ECFCs de embarazos complicados por diabetes mellitus. Sin embargo, esta técnica tiene implicaciones generales más allá del alcance divulgado aquí. Aplicación de este enfoque será mejorar evaluación mecanicista y mejorar lecturas funcionales de vasculogénesis y otros procesos de ramificación biológicamente importantes en numerosos tipos celulares o en Estados de enfermedad.

Introduction

La capacidad de las células progenitoras endoteliales a vasculogénesis, o formación de vasos de novo , es fundamental en el establecimiento de vasculatura embrionaria en desarrollo1. Además, más formación de vasos y la maduración de los vasos preexistentes, que se conoce como angiogénesis, también es un proceso clave en el desarrollo y en la vida postnatal para mantener el flujo de sangre y homeostasis en todo el cuerpo2. Cada órgano en el cuerpo es dependiente sobre el sistema vascular para la entrega de oxígeno y nutrientes y para la eliminación de residuos3. Si no se mantiene la homeostasis vascular, tal que la reparación y formación de vasos sanguíneos son insuficientes o en exceso, enfermedades vasculares pueden producir4. Por lo tanto, adaptación y formación vascular son comúnmente estudiados, ya que son esenciales en el mantenimiento de la salud de órganos y están implicados en el desarrollo de numerosos estados patológicos.

Debido a una mayor comprensión de la participación del sistema vascular en desarrollo, así como en la progresión y la manifestación de la enfermedad, se han desarrollado ensayos modelo vasculogénesis y angiogénesis in vitro y en vivo5 ,6,7. Modelos de formación de vasos consiste en platear las células vasculares, como las células endoteliales, en la matriz de la membrana del sótano que promueve la organización celular y formación de redes de vasos8,9,10. Por lo general, la siguiente noche incubación, imágenes de celular redes son capturadas en un solo momento, resultando en un pequeño número de imágenes para el análisis11,12,13. Por lo tanto, enfoques analíticos en gran parte se han desarrollado y optimizado para vez punto evaluaciones10,14. Sin embargo, el análisis estáticos son simplemente insuficientes en capturar el proceso dinámico de formación de vasos y proporcionan información limitada sobre posibles mecanismos implicados. Aunque el aumento de la frecuencia imagen es probable que proporcionaría los datos necesarios para determinar la cinética de la formación, aplicación de análisis anteriormente desarrollado a un punto multi-tiempo imagen enfoque sería ineficiente y trabajo intensivo14. Además, a pesar del desarrollo de análisis disponibles en el mercado, una tarifa de pago por imagen representa esta opción prohibitiva para estudios cinéticos en los que miles de imágenes son generadas15. Por lo tanto, es una necesidad en el campo de forma ágil y eficiente capturar y cuantificar vasculogénesis en vitro, incluyendo la habilidad para analizar sistemas de ampliación de imagen generadas por microscopia celular en time-lapse.

Para superar estas limitaciones, se desarrolló un nuevo enfoque con el fin de ampliar solo momento la proyección de imagen para permitir la evaluación dinámica de vasculogénesis con imágenes adquiridas cada 15 min16. Por la captura de varios puntos del tiempo durante varias horas, este enfoque proporciona una descripción más detallada del proceso de vasculogénesis, así como información sobre posibles mecanismos que contribuyen a la formación y mantenimiento de redes de vasos. Además de mejorar la frecuencia y calidad de adquisición de la imagen, este enfoque incorpora nuevo software en forma de un plug-in de código abierto17. El software, que se refirió a como cinética análisis de vasculogénesis (KAV), es una aplicación optimizada que incorpora procesamiento de imágenes y análisis específicamente para sistemas de ampliación de imagen generado por adquisiciones del multi-tiempo punto. KAV analiza imágenes de contraste de fase a través de la segmentación de la imagen seguido del skeletonization18. Diez parámetros de estructura de red se cuantifican por KAV incluyendo: ramas, redes cerradas, nodos, red áreas, estructuras de red, nodos ramificados triple, nodos ramificados quad, longitud total de la rama, longitud promedio de la rama y la rama al cociente de nodo (véase esquema en la figura 1)16. Aplicación del enfoque KAV incluye un fenotipo nuevo, calculado de en vitro vasculogénesis, conocido como la rama al cociente de nodo. Nuestro trabajo reciente demostró que esta relación es indicativa de la conectividad de red y puede estar asociada con otros procesos celulares implicados en la formación de la red, tales como la motilidad16.

Aunque en estos estudios se evaluaron la fetal endoteliales formadoras vasculogénesis (ECFC) de la célula, este enfoque de adquisición y análisis de imagen puede aplicarse fácilmente para evaluar cualquier tipo de célula que se someten a vasculogénesis o angiogénesis. Además, este enfoque puede utilizarse para identificar la alteración de la función vascular resultante de una variedad de estados patológicos como diabetes gestacional, como se muestra en estos estudios. Además, este método podría ser adaptado para evaluar la formación de redes y sucursales, que son importantes para otros procesos biológicamente relevantes. Así, el impacto potencial de la aplicación de este nuevo enfoque a los sistemas biológicos únicos es ser determinada.

Protocol

1. preparaciones Cultura Colonia endotelial formando células (ECFCs)Nota: Muestras ECFC Fetal utilizadas en estos experimentos fueron aisladas de sangre de cordón umbilical humano y cultivadas por la Angio ¬ ciones (ABC) en la Indiana University School of Medicine, como se describió anteriormente6. Phenotyping de rutina control de calidad se llevó a cabo dentro de la ABC para confirmar la expresión de los antígenos endoteliales como descrito previamente19,20,21. Las muestras utilizadas en los experimentos fueron pasadas como mínimo (2 – 3 veces). Todos los trabajos de cultivo de tejidos fue realizado en una campana de cultivo de tejidos. Todos los reactivos, incluyendo las placas de cultivo de tejidos y soluciones, fueron estériles. Dos días antes del experimento, capa 100 mm alrededor de las placas de cultivo de tejidos con 6 mL de colágeno de tipo 1 de 0,05 mg/mL e incubar a 37 ° C durante la noche.Nota: Colágeno del tipo 1 se diluye en agua destilada doble que contiene ácido acético de 20 nM a una concentración de trabajo de 0,05 mg/mL. El día antes del experimento, trypsinize y replate ECFCs en las placas de colágeno 1 cubierta tipo en 1.1.1. (Ver nota en el punto 1.1). Para trypsinize ECFCs, los medios de comunicación de las células plateadas de aspirar y lavar con 7 mL de PBS. Aspirar PBS, luego añadir 2-3 mL de tripsina 0,5% e incubar células 2-5 minutos a 37 ° C. Inmediatamente después de la incubación con tripsina, añadir 3 mL de EGM2 y pipeta hacia arriba y hacia abajo para remover todas las células adherentes. Transferir la suspensión a un tubo cónico de 15 mL. Centrifugar las muestras a 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y resuspender los pellets de células en 1-2 mL de EGM2. Homogeneizar la suspensión de células y saque una pequeña alícuota (20-40 μL) para contar. Agregar partes iguales trypan azul a la celda alícuota y Pipetear 10 μL en un hemocitómetro. Contar el número de células en los cuatro cuadrantes principales del hemocitómetro.Nota: Use ambos lados del hemocitómetro para todas cuentas de muestra para aumentar la precisión. Lavar las placas de cultivo de tejido recubierto de colágeno, que fueron preparadas en el paso 1.1.1, dos veces con 7 mL de PBS. Después de la aspiración del segundo lavado PBS, añadir 10 mL de medio de crecimiento endotelial 2 (EGM2) medio suplementado con suero bovino fetal 10% a las placas de cultivo. El recuento obtenido en el paso 1.1.7, calcular el volumen de la suspensión celular para células de placa 4 x 105 . Placa 4 x 105 ECFCs en las placas de cultivo de tejidos preparados en el paso 1.1.8 e incubar a 37 ° C y 5% de dióxido de carbono (CO2) durante la noche. Antes del experimento, almacenar suministros a 4 °C durante la noche Almacenar una placa metálica de 3 “x 2”, diapositiva (subsistencia en paquete hasta abrir en campana), una caja de puntas estériles de microlitro (μL) 20 y la membrana del sótano (matriz).Nota: La matriz se mantiene a-80 ° C para almacenamiento a largo plazo; siempre lo descongelar a 4 º C durante la noche o durante varias horas antes de usarlo. Confirmar la disponibilidad de espacio adecuado para las imágenes en discos duros de ordenador.Nota: Utilizando la configuración que se describe en este protocolo, aproximadamente 60 gigabytes (GB) de espacio fueron requeridas por el experimento (4 GB/pozo). Sin embargo, las estimaciones de espacio se basan en la configuración de hardware y tendrán que ser determinada para cada sistema. 2. Protocolo n ° 1: Montaje Experimental: preparar la diapositiva Reunir y preparar suministros El día del experimento, reunir suministros para el revestimiento de las células en el portaobjetos, incluyendo un cubo de hielo, un recipiente de hielo seco, un par de tijeras y una pipeta de 20 μL. Rociar todos los artículos con etanol al 70%, secar con toallas de papel y coloque los artículos en una campana de cultivo estériles para tejidos. Reúna los suministros almacenados a 4 ° C (véase el paso 1.2) incluyendo la placa de metal, caja de consejos, diapositiva y matriz. Rociar la caja de puntas con etanol al 70% y colocar la caja en el contenedor de hielo seco.Nota: quitar matriz de la nevera de 4 ° C sólo cuando esté listo para usar y mantener siempre la matriz en el hielo. Rociar la placa metálica con etanol al 70% e incrustar en el hielo en el cubo de hielo. Abrir el paquete que contiene la diapositiva y colocar el portaobjetos en la placa de metal para mantenerlo frío. Matriz de carga en la diapositiva Establecer la pipeta de 10 μL y saque la punta de la punta fría caja con la pipeta. Corte aproximadamente 1 cm del extremo de la punta con las tijeras.Nota: corte perpendicular a la punta para reducir burbujas en la matriz. La pipeta se puede establecer en un volumen ligeramente superior a 10 μL para tener en cuenta para pegarse en el interior de la punta de la matriz. Poco a poco dibuja la matriz en la punta. Inmediatamente Coloque la punta de la pipeta en el centro del pozo. Toque suavemente la punta de la pipeta hasta el fondo del pozo y lentamente empuje la matriz hacia fuera.Nota: no no en pipeta, ya que esto hará que las burbujas para formar. Si se una forma de burbuja, pop inmediatamente con una punta pequeña. La diapositiva contiene 15 pocillos individuales. Repita el paso anterior para cada pozo. Utilice una nueva pipeta para cada pozo para mantener la consistencia y reducir la matriz de solidificación dentro de la punta. Una vez que la corredera está cargada con todos los pozos que contienen matriz, empuje la tapa en la diapositiva e incubar a 37 ° C durante 30-60 min hasta que la matriz se solidifica.Nota: No deje la matriz seca. Añadir un pequeño volumen (2-3 mL) de PBS en la tapa de un tubo cónico de 50 mL junto a la diapositiva en la incubadora para reducir el riesgo de secado de la matriz. 3. Protocolo 2: Galjanoplastia ECFCs sobre la matriz de Quitar adherente ECFCs de las placas de cultivo de tejidos y recoger en suspensión Obtener el cultivo de tejidos, placas que contienen el ECFCs plateadas el día anterior (véase la sección 1.1.9). EGM2 medios de aspirar y lavar los adherente ECFCs una vez con 7 mL de PBS. Aspirar PBS, añadir 2-3 mL de tripsina e incube las células adherentes 2-5 minutos a 37 ° C. Inmediatamente después de la incubación, añadir 3 mL de EGM2 y pipeta hacia arriba y hacia abajo para remover todas las células adherentes. Transferir la suspensión a un tubo cónico de 15 mL. Repita los pasos 3.1.1-3.1.3 para las muestras restantes de ECFC tres hasta que se recogen todas las muestras de cuatro células en suspensión. Preparar mezclas de maestro Centrifugar las muestras a 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y resuspender los pellets de células en 1-2 mL de EGM2. Homogeneizar la suspensión de células y saque una pequeña alícuota (20-40 μL) para contar. Agregar partes iguales trypan azul a la celda alícuota y pipetee 10 μL en un hemocitómetro. Contar el número de células en los cuatro cuadrantes principales del hemocitómetro.Nota: Use ambos lados del hemocitómetro para todas cuentas de muestra para aumentar la precisión. Usando la célula cuenta desde arriba, calcular el volumen de cada muestra de células que contiene 1.4×104 células. Homogeneizar suspensiones celulares todos y alícuota 1.4 x 104 células en un tubo fresco para preparar una mezcla maestra para cada condición experimental. Agregar EGM2 los medios de comunicación para que el volumen final de cada master mix es 175 μL. Mezcla cada maestro por pipeteo y alícuota 50 μL de mezcla principal en pocillos individuales de la diapositiva.Las muestras Nota: todas se platean por triplicado, con mezclas principales calculadas para que 3,5 pozos garantizar el suficiente volumen para 3 pozos. Incubar el portaobjetos Incube el portaobjetos a 37 ° C hasta que se pueda mover en la cámara de microscopio para la proyección de imagen.Nota: El tiempo entre el forro y la proyección de imagen debe ser tan breve como sea posible limitar pérdida de datos durante las etapas tempranas de la vasculogénesis. 4. Protocolo 3: Configuración del microscopio y adquisición de imágenes Nota: Para nuestros estudios, los protocolos 2 y 3 se llevaron a cabo simultáneamente por diferentes personas. Si los protocolos 2 y 3 debe ser completado por el mismo individuo, protocolo de 3 pasos 4.1 y 4.2 a continuación debe completarse antes de iniciar el Protocolo n ° 2 anterior. Encienda el microscopio y la computadora Aproximadamente una o dos horas antes de comenzar el experimento, encender y precalentar la incubadora superior etapa a 37 ° C, fijar el CO2 al 5% y ajustar la humedad al 85%. Llenar depósito de humedad de la incubadora, si está vacío. Colocar un portaobjetos cámaras vacías en una de las dos posiciones abiertas y llenar con agua destilada. Sujete el termómetro de la retroalimentación para el control de la temperatura de cámara, si está disponible.Nota: Si el termómetro de la regeneración está disponible, use esta “temperatura de la incubadora” para verificar que la cámara ha equilibrado. Encienda un ventilador secundario a 39-42 ° C para calentar los portaobjetos desde abajo y reducir al mínimo la condensación. Agregar una segunda diapositiva como un espacio en blanco hasta la diapositiva experimental puede añadirse. Esta diapositiva sirve como un marcador de ubicación para la configuración de los parámetros de adquisición de imagen de pocillos individuales durante la instalación. Añadir agua al embalse de alrededor de los pozos en la segunda diapositiva para imitar las condiciones durante el experimento de la proyección de imagen. El agua que rodea los pozos permite la evaluación de la humedad durante la configuración del microscopio y precalentamiento.Nota: Equilibrado antes de la etapa superior de la incubadora y ventilador secundario es fundamental para mantener un ambiente de cultivo estable. Mayoría de los controladores cámara vivo de la célula da retroalimentación en tiempo real de la temperatura, CO2y la humedad para evaluar la preparación del sistema. Antes de continuar, revise la acumulación de humedad en la diapositiva y sequedad excesiva del depósito llena en 4.1.5. Humedad puede necesitar ser ajustado si hay excesiva sequedad o condensación en la cámara. Para aumentar la humedad, agregue toallitas mojadas con agua destilada. Para reducir la condensación, o disminuir el ajuste de humedad como en 4.1.1 o como condensación podría ser un signo de baja temperatura, compruebe los ajustes de temperatura de la cámara y el posicionamiento de la unidad secundaria. Configurar ajustes de imagen básicos de adquisición durante el equilibrado.Adquisición de la Nota: imagen se configura a través del software que controla la etapa, el obturador y la cámara. Una herramienta de configuración multidimensional es la forma más fácil de configurar el software. Además, el software tendrá que tener rutinas de enfoque automático para asegurar el control de foco sobre la duración del experimento. Utilice el software para establecer múltiples posiciones de etapa para cada pozo. De este protocolo, seleccione el centro de los pozos. Configurar la adquisición de la imagen tal que en cada posición, todo el bien está reflejado. Por ejemplo, utilizar un tilescan con superposición de imagen de 10-20% y los campos de aproximadamente 5 x 5, dependiendo de la cámara y el aumento final. Configurar el lapso de tiempo para la proyección de imagen cada 15 minutos.Nota: Utilizando la configuración que se describe en este protocolo, 15 todos los pozos de la diapositiva son imágenes dentro de un intervalo de 15 minutos. Cargar la diapositiva experimental Después de conseguir el equilibrio de la cámara de la incubadora, vuelva a colocar la diapositiva en blanco con la diapositiva experimental.Nota: una cámara de equilibrado tendrá temperatura estable, CO2y humedad durante al menos 20 minutos. Una vez que la diapositiva experimental, es imperativo que los pasos se completan rápidamente para minimizar el “tiempo muerto” entre chapado y el punto de tiempo inicial capturadas por el microscopio. Además, para facilitar la comparación entre imágenes de experimentos, esta vez debe ser coherente. En estos experimentos, todos los pasos descritos en el protocolo 3 Sección 4.3 requieren aproximadamente 30 minutos para completar. Retire la tapa de la diapositiva y agregar agua al embalse de alrededor de los pozos en la diapositiva.Nota: La tapa durante el experimento de la proyección de imagen. Configurar las opciones de adquisición de imagen final Coloque el objetivo de CFI Plan Fluor DL 10 X y seleccionar el anillo de fase Ph1 en el condensador. Con el primer pozo en foco, ajustar la trayectoria de la luz diascópica para la iluminación de Köhler y configuración óptica fase comprobando la alineación del anillo de fase en el condensador con la máscara de fase objetiva. Configurar el tiempo de exposición y ajuste la intensidad de la lámpara para contraste de fase, que suele ser de menos de 500 ms. Ciclo a través de cada etapa posición en 4.2.1 y confirmar que el centro del pozo es seleccionada y ajustar, si es necesario. En cada posición, se centran en las células del plateado en el pozo y fijar la posición de z de la posición utilizada para la proyección de imagen en el software. Pruebe el mecanismo de enfoque automático para el microscopio. Si el enfoque está basado en hardware, asegúrese de que está en y correctamente posicionados para las posiciones de la etapa.Nota: como la muestra y la fase pueden deriva vertical durante el experimento, es importante que el software Compruebe el enfoque automático en cada posición y en cada momento para asegurar la proyección de imagen confiable durante el curso del tiempo. Si es posible, una posición de enfoque automático determinada en el punto anterior del tiempo puede usarse como punto de partida para la rutina de enfoque posterior. Esta forma deriva en curso puede ajustarse para fácilmente. Reducir o apagar las luces en la sala de microscopio y empezar el experimento de la proyección de imagen. 5. Protocolo 4: Procesamiento y cinético análisis de vasculogénesis (KAV) de la imagen Guardar imágenes desde los puntos de tiempo individuales como una pila de imagen para cada pozoNota: la mayoría del software de captura de imagen puede exportar TIFF multipágina (pilas) de series de tiempo. KAV es diseñado para trabajar en conjuntos de datos que pueden incluir varios puntos de tiempo. Así, el análisis ocurre en la pila de toda la imagen para una posición dada. Si es necesario, el software de procesamiento de imágenes pueden importar imágenes desde cada punto de tiempo para reconstruir una pila de imágenes. Abrir el software en el equipo de procesamiento de imágenes Añadir KAV al software de procesamiento de imágenes Arrastre el archivo KAV desde una carpeta en la barra gris en la parte inferior de la ventana del software. Haga clic en ‘Guardar’ para agregar el software a la lista. Abrir la pila de la imagen a analizar Haga clic en ‘archivo’ y luego ‘Abierto’ a través del menú desplegable en el software de procesamiento de imágenes, o arrastrar el archivo de imagen en la barra gris como en el paso 5.3.1. Convertir las imágenes a 8 bits haciendo clic en ‘Imagen’, ‘Tipo’, ‘8 bits’. Crear una región de interés (ROI) Abra el administrador de ROI haciendo clic en ‘Analizar’ en la barra de herramientas. Continuación, seleccione ‘Herramientas’ seguidos por ‘ ROI Manager’. Crear un nuevo retorno de la inversión haciendo clic en las herramientas de selección círculo o rectángulo en la barra de herramientas y dibujar el área de selección deseada en la imagen. Haga clic en ‘Agregar’ en la ventana de administrador de ROI para guardar la forma.Nota: Se puede abrir un ROI creado anteriormente arrastrando guardado ROIs (carpeta comprimida) en la barra de ‘Arrastrar y soltar’ para abrir en administrador. Haga clic en la etiqueta de retorno de la inversión aparece en el administrador de ROI para ver en la imagen.Nota: Si el ROI no aparece en la imagen, crear un segundo retorno de la inversión (cualquier tamaño y la forma) y añadir al Gerente. Una vez que ambos ROIs aparecen en la lista, haga clic en hacia adelante y hacia atrás entre los dos y el ROI deseado aparece en la imagen. Alinee el retorno de la inversión si es necesario. Una vez el retorno de la inversión en la imagen en la ubicación deseada, vaya al menú y haga clic en ‘Editar’ entonces ‘Claro fuera’. Esto borrará los datos de imagen fuera de la ROI (útil para formas no rectangulares) para cada imagen en la pila.Nota: Usted puede también hacer clic en ‘Imagen’ y ‘Cultivo’ si usas un ROI rectangularly formado. Ejecutar el software KAV Haga clic en ‘Plug-ins’ en la barra de menús. Seleccione la ‘red de analizar’ plug-in. Se abrirá una ventana con opciones para modificar la configuración del plug-in. Cambiar el método de umbralización utilizando la flecha desplegable. Una vez seleccionadas todas las opciones apropiadas, haga clic en ‘Aceptar’ para iniciar el proceso de software.Nota: Ajustes correspondientes se determinan a través de la visualización del esqueleto y la máscara de copias generadas por KAV, que son indicativas de la precisión del software para identificar y discernir las células y redes de fondo de la imagen de contraste de fase. Guardar los datos generados por el KAV Una vez que el plug-in ha terminado el análisis, aparecerán dos ventanas en la pantalla incluyendo una tabla de datos con valores numéricos y una pila de imágenes fundidas que representan copias de esqueleto y la máscara. Guarde los valores numéricos desplazándose a la esquina superior izquierda de la tabla de datos y haga clic en ‘editar’ entonces ‘copiar’ o ‘Corte’ para pegar valores en una hoja de cálculo de excel. Haga clic en la imagen fusionada de esqueleto y la máscara. Guarde la pila de la imagen de esqueleto/máscara fundida como un archivo TIFF Tagged Image File Format () haciendo clic en ‘Archivo’ ‘Guardar como’ ‘TIFF’. Guardar el contraste de fase recortada imagen pila (creado usando ROI) haciendo clic en ‘File,’ ‘Guardar como’ ‘TIFF’. Haga clic en la ventana ROI Manager y seleccione el ROI utilizado para recortar las imágenes. Haga clic en ‘More’ seguido de ‘Guardar’ para guardar el ROI para uso futuro.Nota: Utilizando el mismo ROI le ayudará a mantener la consistencia a través de análisis.

Representative Results

KAV produce representaciones visuales de la estructura de la redEl contraste entre el ECFCs y el fondo de la matriz en las imágenes de contraste de fase permite KAV identificar estructuras celulares específicas. Redes ECFC identificadas por KAV se representan gráficamente como copias del esqueleto y la máscara para ilustrar las estructuras utilizadas por el software para la cuantificación (figura 2A). Lo importante, evaluación cualitativa de las copias del esqueleto y la máscara permite la identificación rápida de KAV sensibilidad y precisión, que puede ser útil en determinar configuraciones de umbral óptimo e interpretación de los resultados del análisis. Cuando la calidad de las imágenes de contraste de fase es alta y se logra suficiente contraste, KAV con precisión identifica redes ECFC según lo indicado por la semejanza entre la imagen de contraste de fase y el KAV generado esqueleto y la máscara copias (figura 2 A y Video 1). Alternativamente, si imágenes de contraste de fase no tiene alto contraste o artefactos de la proyección de imagen tales como la red se producen, se reduce la precisión de detección de red y los resultados se convierten en ambiguos (figura 2B). Además, la formación de burbujas de aire dentro de los medios de comunicación de la célula también puede ocultar precisión de detección (figura 2). Sin embargo, problemas con calidad de imagen a menudo pueden ser superados mediante la selección de métodos de umbral diferentes incluidas en el software KAV. Por ejemplo, la imagen de contraste de fase en la figura 2B se analizó utilizando la configuración de procesamiento de imagen idéntica excepto por el método de umbralización. De las copias del esqueleto y la máscara, es evidente que el umbral Otsu dio lugar a una detección más precisa de las redes ECFC que se muestra en la imagen de contraste de fase (figura 2B). Por lo tanto, la calidad de imagen es fundamental para lograr resultados precisos y significativos en este ensayo. Sin embargo, umbralización diferentes métodos incluidos en la interfaz de usuario KAV permiten ajuste de análisis de imagen basado en la calidad de las imágenes de entrada. Time-lapse microscopia identifica diferencias cualitativas y cuantitativas en vasculogénesis ECFC después de la exposición intrauterina a diabetes gestacionalRecientemente, el enfoque analítico de KAV se aplicó para valorar la función ECFC fetal tras la exposición materna tipo 2 mellitus de la diabetes (T2DM) en el útero16. Usando KAV, alteración cinética de vasculogénesis identificaron en ECFCs fetales expuestas a T2DM. Sin embargo, además de T2DM exposición, que se produce a lo largo de la gestación toda, diabetes mellitus gestacional (GDM) o el desarrollo de intolerancia a la glucosa comúnmente en el tercer trimestre del embarazo, también deteriora ECFC función13. Por lo tanto, para determinar si ECFCs expuestos de GDM también mostrarán alteración cinética de formación de redes ECFC se aplicó KAV. Fase 1 (0-5 h) y fase 2 (5 + h) fueron evaluados utilizando tiempo microscopia lapso junto con análisis KAV (figura 3). Imágenes de contraste de fase representativa adquirieron al inicio de la adquisición de la imagen (0,50 h) y durante todo el curso del tiempo (5.00 y 10.00 h) representan la formación de redes ECFC en las cuatro muestras analizadas de un solo día experimental (figura 3 y Video 1 ). A pesar de la célula equivalente de carga, como se observa en las imágenes de contraste de fase a las 0,50 horas, diferencias cualitativas en la estructura de la red son evidentes en los puntos de tiempo 5,00 y 10,00 horas. ECFCs del embarazo sin complicaciones (UC) forman una red compleja e intrincada 5 horas después de la galjanoplastia, similar a nuestros datos previamente publicados16. Por el contrario, la ECFCs de GDM muestra 1 formulario (GDM1) muy pocas estructuras que no están interconectadas de la red. Sin embargo, este patrón no se refleja en todas las muestras ECFC obtenidas embarazos GDM, indicativos de la heterogeneidad entre las muestras. Muestras GDM2 y GDM3 Mostrar mayor formación de la red en comparación con GDM1, aunque los patrones de conectividad alterados en comparación con la muestra de la UC. Lo importante, KAV mide varios componentes estructurales de las redes ECFC para identificar fenotipos obvios y sutiles. Además de generar copias de esqueleto y la máscara de la estructura de la red, KAV quantitates diez indicadores de estructura de red, incluyendo el número de estructuras de red, nodos, nodos ramificados triple, nodos cuádruple-ramificado, ramas, total longitud de la rama, longitud de rama media, redes de sucursales y nodo, total cerrado y red área16. KAV compila los datos de cada muestra en una sola tabla de valores para todas las imágenes del curso del tiempo. La tabla 1 incluye datos representativos de un estudio de proyección de imagen para una muestra ECFC. Parámetros de estructura de la red medido por KAV se organizan en columnas y los datos de imágenes secuenciales adquiridas con el tiempo se organizan en filas. Por ejemplo, en nuestros estudios, imagen 1 se obtuvo 30 min post chapado con imágenes posteriores ser recogidos cada 15 minutos los valores Raw generados por KAV entonces puede graficar o más analizadas utilizando estadísticos más complejos acerca a16. Se muestran cinco gráficos que representan los valores medios de la estructura de la red de tres experimentos independientes para una sola muestra sin complicaciones (UC) y las tres muestras GDM (figura 4). La muestra de la UC en estos experimentos llevados a cabo de manera similar al previamente analizados UC muestras16. Anteriormente, se identificó que la ECFC vasculogénesis in vitro es bifásico, que consta de la fase 1 (0 – 5 h) y fase 2 (5-10 h)16. Este patrón es consistente en los estudios actuales, como lo demuestra el gráfico que representa datos de la red cerrada (figura 4). La muestra UC formó un mayor número de redes cerradas en comparación con los tres de las muestras GDM. Curiosamente, tres de las cuatro muestras parecen tener un tiempo similar al máximo número de redes cerradas, que se produce entre 2,5 y 3 horas. Sin embargo, la muestra GDM2 fue más lenta alcanzar máximas redes cerradas, que se produjeron horas después de la galjanoplastia. Y, a pesar la muestra GDM2 formando redes máximas menos en comparación con la muestra de la UC, las redes de forma mantuvieron de manera similar a la muestra de la UC con el tiempo. Por el contrario, GDM1 y GDM3, que formaron redes menos en comparación con la muestra de la UC, también exhibieron una reducción general en el número de red en el tiempo. En general, de la gráfica que representa el número de red cerrada, es evidente que todas las muestras ECFC muestran un patrón bifásico de la formación de la red, sin embargo la tasa de formación y el número máximo de lograr las redes varían de muestras. Área de red representa el área promedio dentro de las redes cerradas formadas por el ECFCs. Por lo tanto, cuanto mayor sea la red cerrada número, el más pequeño las áreas de la red. Este patrón se refleja en los gráficos de área de red donde la muestra de la UC, que formó un mayor número de redes cerradas, tenía áreas más pequeñas de la red con el tiempo en comparación con las tres muestras GDM (figura 4). GDM2, que alcanzó la máximas redes cerradas más lentamente, exhiben área red alta inicialmente, sin embargo la zona estabilizada en el tiempo y esto fue más parecida a la muestra de la UC a las 15 horas. Con el tiempo, la zona media de la red en todas las muestras aumentó debido a la estabilización de la red. Sin embargo, algunas muestras, como GDM1 y GDM3, exhibieron un aumento más rápido en el área de la red, que es probablemente indicativo de estabilidad disminuida en comparación con otras muestras exhibiendo un aumento más gradual. Expuestos al GDM ECFCs exhiben estabilidad de red reducidaLa proporción de ramas en los nodos es un fenotipo nuevo calculado por KAV e identificado en nuestros estudios anteriores, y esto es indicativo de red Conectividad16. En el presente estudio, la muestra de la UC tenía una proporción baja, que representaba un alto nivel de conectividad de red que se mantuvo en el tiempo (figura 4). Por el contrario, las tres muestras GDM tenían un cociente más alto de las ramas de los nodos, especialmente en la fase 2 de formación de redes. Esta observación demuestra la estabilización de las estructuras de red y conectividad reducida. En general, GDM1 formado menos nodos y ramas en comparación con las otras muestras, con la reducción mantenida a lo largo del experimento. GDM2 y GDM3 forman y mantenido un mayor número de ramas en comparación con la muestra de la Universidad de California, especialmente entre 5-15 h. El número de nodos en las redes GDM2 y GDM3 era más similar en el número de nodos en la muestra de la Universidad de California, especialmente entre 10-15 h. Un mayor número de ramas, pero un número similar de nodos, podría explicar la rama mayor relación nodo evidente en los puntos de tiempo posteriores en las muestras GDM. Importante, cambios simultáneos en rama y nodo el número pueden ser difíciles de interpretar en gráficos separados. Sin embargo, la novela rama relación nodo ofrece una manera de evaluar cómo provocar cambios, incluyendo cambios leves difíciles de detectar en los gráficos individuales, en número de rama y de nodo, conectividad de red alterada. Figura 1 : Esquema delineando 10 parámetros cuantificados por análisis cinético de vasculogénesis (KAV). KAV quantitates diez parámetros distintos de la estructura de la red. Todos los parámetros están codificados por color y se indica en el esquema numérico (1-10). Los parámetros incluyen el número de redes de sucursales (verde, 1), cerrados (azul, 2), y nodos (rojo, 3), promedio de área de red (naranja, 4), el número de estructuras de la red (negro, 5), los nodos ramificados triple (amarillo, 6) y ramificados de cuatro nodos (púrpura, 7), así como total (9) y longitud media de la rama (10) y el cociente entre el número de ramas en el número de nodos (10). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2 : Análisis cinético de vasculogénesis (KAV) quantitates estructura de la red. (A) copias de esqueleto y la máscara de red estructuras identificadas por KAV con fase contraste imágenes proporcionan una representación visual de estructuras de red identificada y cuantificada por KAV. Barra de escala = 500 μm. (B) una imagen de contraste de fase representativa de ECFC redes 10 h la galjanoplastia que tiene poco contraste y rejilla marca de sutura imágenes individuales. Métodos diferentes de umbralización, como media o Otsu, pueden seleccionarse en el KAV plugin para mejorar la precisión de la cuantificación, si imágenes de contraste de fase tienen bajo contraste o si se produce la red. Métodos de media y Otsu umbral se muestran copias de esqueleto y la máscara de la imagen de contraste de fase. Imágenes de contraste de fase fueron capturados utilizando un objetivo de X 10. Barra de escala = 500 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3 : Exposición de GDM intrauterina altera la formación de redes ECFC. Imágenes de la formación de redes ECFC fueron capturados a intervalos de 15 minutos para 15 h por microscopía de contraste de fase. Imágenes de contraste de fase representativa en incrementos de 5 h, a partir de la hora de platear (0,5 h), se presentan para la UC y tres muestras GDM. Imágenes de contraste de fase fueron capturados utilizando un objetivo de X 10. Barra de escala = 500 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4 : ECFCs expuestos a intrauterina cinética de formación GDM exposición alterado red. ECFCs se obtuvieron de un embarazo sin complicaciones (UC, negro) y tres embarazos complicados por diabetes gestacional (1-3, rojo GDM). Imágenes de contraste de fase fueron capturados en el min 15 intervalos de 15 h. software de análisis cinético de vasculogénesis (KAV) cuantificado cerrados redes, áreas de red, ramas, nodos y la proporción de ramas en los nodos. Los datos ilustrados representan la media ± error estándar de la media (SEM) de tres experimentos independientes para cada muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Video 1: Exposición de GDM intrauterina altera la cinética de formación de redes ECFC. Imágenes de la formación de redes ECFC fueron capturados a intervalos de 15 minutos para 15 h por microscopía de contraste de fase. Imágenes de contraste de fase se presentan para la UC y tres muestras GDM más de 15 h a partir de 0.5 h. La barra de escala representa 500 μm. por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar) Imagen Total rama redes Nodos de Triples Cuádruples Sucursales Total rama longitud * Longitud de rama de AVG * Rama nodo relación Redes cerradas Red área ** 1 382 290 278 11 943 47210 124 3.25 9 480214 2 284 345 337 8 940 50699 179 2.72 16 264469 3 205 376 366 9 910 55728 272 2.42 27 150621 4 162 422 407 15 947 59692 368 2.24 40 98713 5 132 454 441 12 967 61923 469 2.13 53 72951 6 122 435 419 14 907 62587 513 2.09 68 56948 7 88 429 411 17 852 63983 727 1.99 74 51429 8 68 451 437 13 874 63960 941 1.94 74 51780 9 93 437 417 18 905 60901 655 2.07 49 82919 10 126 511 487 24 1075 61981 492 2.1 37 116857 11 49 397 384 12 737 61823 1262 1.86 79 48805 12 81 376 364 10 751 56817 701 2 63 64431 13 98 509 482 26 1028 60799 620 2.02 44 98056 14 93 449 416 31 909 58282 627 2.02 45 94081 * redondea al más cercano micrones, ** redondea al más cercano micrones ^ 2 Tabla 1: Datos crudos representativos de proyección de imagen de un estudian de una muestra ECFC.

Discussion

KAV permite evaluación de conjuntos de datos grandes con varios puntos de tiempo
Tradicionalmente, la cuantificación de la vasculogénesis en vitro ha consistido en una sola o unas mediciones de punto de tiempo. Este enfoque estático es simplemente insuficiente para capturar y cuantificar un proceso dinámico y complejo. Por lo tanto, este nuevo método fue desarrollado para permitir la eficientes análisis de la cinética de formación de la red para profundizar en los posibles mecanismos moleculares implicados en el proceso dinámico de vasculogénesis. Eficiencia y automatización son componentes importantes en el desarrollo de nuevas técnicas para generar y analizar grandes cantidades de datos de imágenes. KAV se desarrolló específicamente para analizar pilas de ampliación de imagen consisten en cientos de imágenes para disminuir el tiempo y mano de obra necesaria para derivar conclusiones propósito biológico de Time-lapse conjuntos de datos. Lo importante, KAV realiza procesamiento de imágenes y generación de datos en cuestión de segundos para los pequeños (menos de 100 imágenes) imagen pilas y minutos más grande (más de 100 imágenes) pilas, dando por resultado eficacia sin par de la imagen. Además, organización de datos en hojas de cálculo por el tiempo y los parámetros medidos permite la rápida generación de presentación y análisis estadístico.

Desafíos en la aplicación exitosa de este enfoque
Aunque este ensayo incluye mejoras en la adquisición de imágenes y análisis, algunos de los desafíos pueden impedir la implementación exitosa. Los cuatro principales obstáculos incluyen estabilidad de humedad, precisión de sincronización de galjanoplastia para la adquisición de imágenes, software y hardware confiabilidad y gestión de grandes conjuntos de datos generados para cada experimento. Imágenes de células vivas estable durante varias horas pueden ser difícil. Específicamente, humidificación adecuada y coherente se requiere para las cámaras de proyección de imagen. Diapositivas de angiogénesis se utilizan en este ensayo, que se diseñan para compiladores basados en matriz angiogénesis ensayos. Su bajo volumen, aproximadamente 50 μL, hace de evaporación y condensación consideraciones importantes para las condiciones de cultivo extendido. Para combatir este problema experimental, es necesario utilizar una incubadora que regula la humedad. Sin embargo, también puede ser necesario aumentar este Reglamento si sequedad excesiva de la cámara de proyección de imagen se produce con el tiempo. Se encontró que el enfoque más sencillo para aumentar la humedad es aumentar la superficie de agua en la cámara. Para lograr este objetivo, nuestro protocolo indica las siguientes tres fuentes de agua: una segunda diapositiva cámara llenas de agua, que es también donde se mide la temperatura de la incubadora, agua en los alrededores de los pozos en las diapositivas y papel de filtro impregnada o toallitas húmedas. Por el contrario, se produce condensación cuando la temperatura del aire en la habitación enfría la parte inferior de la diapositiva y la humedad dentro de la cámara se condensa en las diapositivas y los pozos. Esta complicación puede conducir a una dilución de los medios de comunicación celular y un efecto de lente que interfiere con el contraste de fases. En estos estudios, se minimizó la condensación mediante aplicación de aire caliente (39-42 ° C) en la parte inferior de la diapositiva.

Una consideración clave para cualquier estudio Time-lapse es la consistencia entre el experimento de iniciación y proyección de imagen. El momento cuando comienza la proyección de imagen es fundamental para la interpretación de los acontecimientos posteriores. Para asegurar la precisión de sincronización de este ensayo, el tiempo entre galjanoplastia inicial y el primer punto de la imagen del tiempo debe ser bien controlado. En la práctica, se puede minimizar este “tiempo muerto”, pero más importante aún, debe ser consistente para permitir experimentos en días diferentes para comparar. Por ejemplo, en el presente Protocolo se espera un tiempo muerto de aproximadamente 30 minutos. Esto puede facilitarse por la proximidad de preparación experimental y servicios de imagen.

Lo que podría parecer como detalles mundanos a primera vista son importantes para el software, estabilidad de hardware y gestión de datos. El software y hardware asociado, entorno de red y software automatizado actualiza todos afectan la estabilidad del software. Merece la pena probar este protocolo en un “dry run” para identificar los cuellos de botella y posibles fuentes de problemas en la adquisición de la imagen; por ejemplo, comprobar configuración de células vivas no fiable, confiabilidad de la etapa, el obturador y la cámara y las políticas de tecnología de información institucional sobre sistema operativo automatizado y actualizaciones de software.

Gestión de datos es una preocupación constante de cualquier experimento de la proyección de imagen que genera cientos o miles de imágenes. Afortunadamente, software comercial a menudo busca espacio disponible antes de comenzar un experimento de la proyección de imagen. Sin embargo, este análisis también incluyen procesamiento de imágenes de la captura y análisis que se pueden añadir a la carga de espacio de disco duro e interferir con experimentos, la proyección de imagen si el espacio disponible es limitado. Además, la seguridad y la estabilidad de la computadora no se puede garantizar, incluso con soluciones de hardware como una matriz redundante de discos idénticos. Así, una estrategia de gestión de datos para garantizar espacio en el disco duro del equipo para los experimentos actuales y un robusto archivo remoto, por ejemplo con un recurso de archivo institucional, es necesaria.

Estrategias para maximizar la calidad de la imagen
Aunque la capacidad de KAV para discernir con precisión ECFCs desde el fondo de la matriz es sólida, la sensibilidad del ensayo depende de la calidad de imagen. Por ejemplo, si la imagen tiene poco contraste, el software detectará redes de célula con menos precisión (figura 2B). La calidad del contraste de fase se ve afectada por varios factores, incluyendo la configuración del microscopio utilizado para la adquisición de imágenes, carga de la matriz y los medios de comunicación de suspensión de célula durante la preparación del análisis y el mantenimiento de los niveles medios dentro de los pozos a lo largo de la proyección de imagen. Para optimizar el contraste de fase para estos ensayos, se hicieron pequeños ajustes a la alineación del anillo de fase en el microscopio para mejorar el contraste. Además, preparación de la muestra fue sometido a pruebas rigurosas para asegurar carga media igual y constante. Si la cantidad de matriz o media cargada en los pozos es por debajo o por encima del rango óptimo, un menisco puede formar líderes para contraste de fase alterada. Finalmente, dado el escaso volumen de líquido en los pozos, es crítico para mantener los niveles medios por reducir al mínimo la evaporación y la condensación, como se señaló anteriormente. En general, optimización de análisis es fundamental para generar imágenes de contraste de alta calidad para su análisis.

Además de la calidad de contraste de fase, otros factores también pueden afectar los resultados ensayo incluyendo la contaminación de los medios de comunicación, las imperfecciones de la matriz y las partículas o residuos en la matriz o los medios de comunicación. La contaminación es un peligro de este ensayo ya que se trata de imágenes de células vivas durante varias horas en una sala de microscopía. Para reducir el riesgo de contaminación, las suspensiones de la célula y la matriz se cargan en la diapositiva en una campana estéril. Además, cada muestra se platea típicamente en duplicado o triplicado para un experimento reducir el riesgo de pérdida de datos debido a imprevistos como la suciedad o partículas de confundir el análisis.

Muestra heterogeneidad unidades necesitan para la sensibilidad del ensayo mayor
Heterogeneidad ha sido observada y reportado en estudios previos de ECFCs expuestos a GDM13. Un alto nivel de heterogeneidad en función de las células observada en estas muestras se especula atribuible a varios factores incluyendo la severidad de la enfermedad materna, duración de la enfermedad y estilo de gestión utilizado para regular niveles de glucosa en sangre. Lo importante, este enfoque analítico captura la gama dinámica de ECFC vasculogénesis, lo que es factible identificar diferencias fenotípicas debido a la heterogeneidad funcional en muestras de embarazos GDM. En general, el uso primarios de muestras de pacientes, como los utilizados en estos estudios, puede introducir mayor variabilidad respecto a una línea celular. Como se pone un mayor énfasis en estudios traslacionales con múltiples muestras de animales o humanas primarias con variabilidad funcional, sensibilidad del ensayo es fundamental para la detección y derivación de medidas biológicamente significativas y conclusiones. Por lo tanto, desarrollo de enfoques como KAV mejorará la cantidad y calidad de los datos generados por la angiogénesis y vasculogénesis en vitro ensayos para permitir que más observaciones y conclusiones. Además, estos datos facilitarán futuras investigación de mecanismos moleculares subyacentes que contribuyen a la vasculogénesis ECFC alterados tras la exposición intrauterina de GDM.

Futuras aplicaciones de este enfoque
Aunque este método fue aplicado para evaluar fetal ECFC vasculogénesis en vitro en estos estudios, las posibles aplicaciones de este enfoque son numerosos. Esta técnica se puede implementar fácilmente para estudiar una población celular que participa en el proceso de vasculogénesis o angiogénesis. En concreto, puede ser utilizado para el estudio de las poblaciones individuales de la célula, como se demostró en este estudio, pero también se podría aplicar a los sistemas de co-cultivo. En el futuro, sería beneficioso ampliar este enfoque más allá el análisis bidimensional en vitro para evaluar modelos tridimensionales (3D). Aunque la versión actual de KAV sería insuficiente para la cuantificación de los datos de la proyección de imagen 3D, un enfoque analítico Time-lapse, multi-paramétrico semejantemente diseñado específicamente para los modelos 3D o en vivo informarían si observaciones realizadas en dos dimensiones en vitro son representativos de la función de la célula en un ambiente biológicamente más relevante.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores reconocen Lucy Miller, Leanne Hernández, Dr. David Haas, Brittany Yeley (Indiana University School of Medicine), el Dr. Karen Pollok, Julie Mund, Mateo reabra y Emily Sims (Angio BioCore en el centro de cáncer Universidad Simon de Indiana) para asistencia técnica excelente en derivadas de muestras ECFC. Los autores también reconocen los Drs. Maureen A. Harrington, Edward F. Srour, Richard N. Day, Mervin C. Yoder y Matthias A. Clauss (Indiana University School of Medicine) para discusión académica así como paredes de Janice (Indiana University School of Medicine) para apoyo administrativo. Toda la proyección de imagen se realizó en el centro de Indiana para microscopia biológica, escuela de medicina de la Universidad de Indiana. Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud (R01 HL094725 P30 CA82709 y HD063094 U10) y Fundación de los niños Riley. Además, esta publicación fue posible con el apoyo parcial de nacional del corazón, pulmón y sangre Instituto de los institutos nacionales de salud bajo premio # T32 HL007910.

Materials

100mm Tissue Culture Plates Fisher 353003
15ml conical tubes Fisher 1495949B
Angiogenesis 15-well micro-slides Ibidi 81506
Matrigel Fisher (Corning) 354234
EGM2 Medium Lonza CC3162
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11550
PSA Antimyocytic, Antibiotic Fisher MT30004C1 Added 5 milliliters per 500 milliter bottle of EGM2 medium.
0.5% Trypsin/0.53nM EDTA in HBSS Fisher (Corning) MT25052CI
Type 1 Collagen Fisher (Corning) 354226 100mg of liquid, concentration range 3-4mg/mL. Dilute in 20nM acetic acid in ddH2O to use at a final concentration of 0.05mg/mL.
Glacial Acetic Acid Fisher A38-212 Used in Type 1 Collagen solution at a final concentration of 20nM.
Kim Wipes Fisher 06-666
Chambered slide Ibidi 80296 This slide can be filled with distilled water to maintain humidity in the imaging chamber.
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher (Gibco) 20012027 1x solution, pH 7.2
Microscope Nikon Instruments MEA53100 and MEF55030 Motorized TiE including Ph1 phase ring for phase contrast with objective
Stage Prior Instruments ProScan II Other OKOlab and Nikon Elements AR compatible stage may be used
Objective Nikon Instruments 93178 CFI Plan Fluor DL 10x
Camera Hamamatsu C11440-42U ORCA Flash 4.0LT
Stage Blower Precision Controls N/A This item has been discontinued, alternatives include Smart Air-Therm Heater(AIRTHERM-SMT-1W) from World Precision Instruments
Stage-top Incubator  OKOLabs H301 BoldLine including a two position slide holder
Computer Hewlett-Packard Z620 or equivalent 4 core Intel Xeon processor, >32 GB RAM, >2 TB RAID 10, nVidia Quadro graphics card 
Nikon Elements Software Nikon Instruments AR v 4.20 ND Acquisition is a multidimensional setup tool used to configure Elements software.
FIJI (ImageJ) Software N/A N/A Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://imagej.net/Fiji/Downloads
KAV Plug-In N/A N/A Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://github.com/icbm-iupui/kinetic-analysis-vasculogenesis
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
  2. Tung, J. J., Tattersall, I. W., Kitajewski, J. Tips, stalks, tubes: notch-mediated cell fate determination and mechanisms of tubulogenesis during angiogenesis. CSH Med. 2 (2), 006601 (2012).
  3. Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473 (7347), 298 (2011).
  4. Carmeliet, P. Angiogenesis in health and disease. Nat Med. 9 (6), 653-660 (2003).
  5. Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc. 5 (4), 628-635 (2010).
  6. Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood. J Vis Exp. (62), (2012).
  7. Simons, M., et al. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularization: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circ Res. 116 (11), 99-132 (2015).
  8. Crabtree, B., Subramanian, V. Behavior of endothelial cells on Matrigel and development of a method for a rapid and reproducible in vitro angiogenesis assay. In Vitro Cell Dev-An. 43 (2), 87-94 (2007).
  9. Khoo, C. P., Micklem, K., Watt, S. M. A comparison of methods for quantifying angiogenesis in the Matrigel assay in vitro. Tissue Eng Part C-Me. 17 (9), 895-906 (2011).
  10. Allier, C. P., et al. Video lensfree microscopy of 2D and 3D culture of cells. SPIE BiOS. 8947, 89471 (2014).
  11. Wang, Y., Chen, Q., Zhang, Z., Jiang, F., Meng, X., Yan, H. Interleukin-10 overexpression improves the function of endothelial progenitor cells stimulated with TNF-α through the activation of the STAT3 signaling pathway. Int J Mol Med. 35 (2), 471-477 (2015).
  12. Ingram, D. A., et al. In vitro hyperglycemia or a diabetic intrauterine environment reduces neonatal endothelial colony-forming cell numbers and function. Diabetes. 57 (3), 724-731 (2008).
  13. Blue, E. K., et al. Gestational diabetes induces alterations in the function of neonatal endothelial colony-forming cells. Pediatr Res. 75 (2), 266-272 (2014).
  14. Carpentier, G. . ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer. , (2012).
  15. . WimTube Available from: https://www.wimasis.com/en/products/13/WinTube (2012)
  16. Varberg, K. M., et al. Kinetic analyses of vasculogenesis inform mechanistic studies. Am J Physiol-Cell Ph. , (2017).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Met. 9 (7), 676-682 (2012).
  18. Arganda-Carreras, I., Fernández-González, R., Muñoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. 3D reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue. Microsc Res Techniq. 73 (11), 1019-1029 (2010).
  19. Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
  20. Mead, L. E., Prater, D., Yoder, M. C., Ingram, D. A. Isolation and characterization of endothelial progenitor cells from human blood. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2008).
  21. Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).

Tags

VasculogenesisAngiogenesisKinetic AnalysisLive-cell ImagingQuantitateVessel FormationNetwork Structural PatternsCell PopulationPathologic StateMicroscope Stage Top IncubatorCarbon DioxideHumidityLive-cell ChamberChambered SlideBasement Membrane MatrixMatrigelPipetting

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Varberg, K. M., Winfree, S., Dunn, K. W., Haneline, L. S. Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro. J. Vis. Exp. (131), e57044, doi:10.3791/57044 (2018).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image