Herstellung und Reinigung des Baculovirus für Gentherapie Anwendung
Summary
In diesem Protokoll wird Baculovirus von Transiente Transfektion von Baculovirus Plasmid in Sf9 Zellen produziert und verstärkt in serumfreien SUSPENSIONSKULTUR. Der Überstand wird durch Heparin Affinitätschromatographie gereinigt und weiter durch Ultrazentrifugation konzentriert. Dieses Protokoll eignet sich für die Herstellung und Reinigung des Baculovirus für Gen-Therapie Anwendung.
Abstract
Baculovirus wurde traditionell für die Produktion von rekombinanten Proteinen und Impfstoff eingesetzt worden. Allerdings ist vor kurzem Baculovirus als vielversprechende Vektor für Gen-Therapie-Anwendung entstehen. Hier entsteht Baculovirus durch Transiente Transfektion von Baculovirus Plasmid DNA (Bacmid) in einer haftfesten Kultur Sf9 Zellen. Baculovirus wird anschließend in Sf9 Zellen in serumfreien SUSPENSIONSKULTUR erweitert, bis das gewünschte Volumen erreicht ist. Es wird dann von der Kultur überstand mit Heparin Affinitätschromatographie gereinigt. Virus Überstand wird auf die Heparin-Spalte die Baculovirus Partikel im überstand aufgrund der Affinität von Heparin bindet, denn Baculovirus Glykoprotein umhüllen geladen. Die Spalte wird gewaschen, mit einem Puffer um Verunreinigungen zu entfernen und Baculovirus ist aus der Spalte mit einem hohem Salzgehalt Puffer eluiert. Das Eluat wird verdünnt, um eine isotonische Salzkonzentration und Baculovirus Partikel sind weitere Verwendung Ultrazentrifugation konzentriert. Mit dieser Methode können Baculovirus bis zu 500-fold mit einer 25 % Erholung der infektiöse Partikel konzentriert werden. Obwohl das hier beschriebene Protokoll die Herstellung und Reinigung von der Baculovirus aus Kulturen bis zu 1 L zeigt, die Methode kann in ein geschlossenes System SUSPENSIONSKULTUR, klinische Grade Vektor für Gen-Therapie-Anwendung zu produzieren Aufstockung werden.
Introduction
Baculovirus dient in erster Linie für die Produktion von rekombinanten Proteinen und Impfstoffe in Lepidopteran Spodoptera Fugiperda (Sf) 9 Insektenzellen mittels rekombinanter Autographa Californica multicapsid nuklearen Polyhedrosis Virus (AcMNPV) 1 , 2 , 3 , 4. vor kurzem, es erweist sich als eine vielversprechende Vektor für Gen-Therapie Anwendung5. Es ist bekannt, dass eine breite Host und Gewebe Tropismus, Ruhestrom und wuchernde Zellen infiziert ist apathogen und integriert nicht in die Host-Chromosom4,5,6. Darüber hinaus können Baculovirus in serumfreien SUSPENSIONSKULTUR hergestellt werden, die ist skalierbar und geschlossenes System für zukünftige klinische Produktion1Verarbeitung ermöglicht.
Die Reinheit des Baculovirus Partikel ist wichtig zur Erreichung effektiven Transduktion bei gleichzeitiger Minimierung der Zytotoxizität7,8,9. Baculovirus können durch Ultrazentrifugation oder tangential-Flow Filtration (TFF) mit geringen Auswirkungen auf seine Infektiosität konzentriert werden. Diese Verfahren nicht nur konzentrieren Viruspartikel aber auch zelltrümmer und Proteine aus Sf9 können induzieren Entzündungen oder eine Immunantwort bei Kultur, die giftige in Vitro (persönliche Beobachtung) kann in Vivo. Um dies zu vermeiden, vor allem, wenn mit Virus Aktien konzentriert, muss infektiöse Baculovirus gereinigt und von kontaminierenden Partikel getrennt werden.
Verschiedene Methoden wurden für die Reinigung und Konzentration der Baculovirus Vektoren10,11,12berichtet. Von den verfügbaren Ansätzen ermöglicht Heparin Affinitätschromatographie Einzelschritt hohem Niveau der Reinigung mit der niedrigen Konzentration der kontaminierende Proteine12. Die Methode basiert auf der Identifikation des Heparan Sulfat als Rezeptor für Baculovirus13,14. Nach dem Laden Sf9 Zelle überstand auf die Spalte und die Bindung des Baculovirus, waschbar die Spalte mit physiologischen (Isotone) Puffer ungebunden oder lose gebundenen verunreinigende Partikel zu entfernen. Da die Bindung an Heparin umkehrbar ist, können Baculovirus Partikel mit einem hohen Salz Puffer eluiert die physiologischen (Isotone) Salzkonzentration zu verhindern, dass die Inaktivierung durch osmotischen Schock12sofort verdünnt wird. Darüber hinaus kann die Produktion von Baculovirus sowie Erfassung auf und Elution von der Chromatographiesäule erfolgen über ein geschlossenes System-Prozess, der mit aktuellen gute Herstellungspraxis (cGMP) kompatibel ist.
Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zur Herstellung, Reinigung und Konzentration von infektiösen Baculovirus mittels Affinitätschromatographie und Zentrifugieren. Kurz, wir produzieren Baculovirus durch Transfektion von Sf9 Zellen mit einem Baculovirus Plasmid DNA in adhärenten Kultur und die infektiöse Baculovirus in serumfreien SUSPENSIONSKULTUR weiter ausbauen. Wir reinigen mit Heparin Affinitätschromatographie Baculovirus und mit Ultrazentrifugation als letzten Schritt hoch den Vektor für Gen-Therapie-Anwendung konzentrieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier vorgestellten Protokoll beschreibt die Herstellung von Baculovirus in Sf9 Zellen in SUSPENSIONSKULTUR und Reinigung des Baculovirus mit einem Heparin-Affinitätschromatographie. Die Parameter, die in diesem Protokoll verwendeten den Ertrag maximieren und minimieren die Inaktivierung von infektiösen Baculovirus. Das Protokoll zur Verfügung gestellt hier zeigt, dass eine deutlich verbesserte Regeneration Baculovirus Teilchen im Vergleich zu Rückforderungen von anderen9erreicht.
<p cl…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird teilweise unterstützt durch die Anschubfinanzierung von Cincinnati Children Research Foundation (CCRF) M.N und Innovative Core Grant (ICG) unterstützt durch die nationale Mitte für voran Translational Wissenschaft von den National Institutes of Health unter Award Nr. UL1 TR001425. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.
Materials
| Akta Avant 150 | GE Healthcare | 28976337 | Chromatography system |
| POROS Heparin 50 µm Column | ThermoFisher Scientific | 4333414 | Heparin column |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Non-catalog item | Concentrates virus at high-speed |
| Polyallomer Ultracentrifuge tube | Beckman-Coulter | 326823 | Concentrates virus at high-speed |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| 250 mL Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| 1 L Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238072 | Flask for suspension culture |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of Baculovirus supernatant |
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Tissue culture treated plate |
| 10-cm plate | ThermoFisher Scientific | 08-772E | Tissue culture treated plate |
| Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF | EMD-Millipore | SCHVU05RE | Filtration unit |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | 15160-054 | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| Bac-to-Bac Vector Kit | ThermoFisher Scientific | 10360-014 | Baculovirus expression system |
| DH10B-T1R Competent cell | ThermoFisher Scientific | 12331-013 | Competent cell for bacmid |
| TE buffer | In-house | Non-catalog item | 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0. |
| Plasmid Maxiprep kit | ThermoFisher Scientific | K2100-06 | For bacmid purification |
| Sf9 Cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Grace’s Insect Cell Culture Medium | ThermoFisher Scientific | 11605-094 | Transfection medium |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012227 | Washing cells, diluting samples |
| HyClone SFX-Insect cell media | GE Healthcare | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Baculovirus plasmid (bacmid) DNA | In-house | Non-catalog item | Bacmid for Baculovirus Production |
| Cellfectin II | ThermoFisher Scientific | 10362 | Transfection reagent for insect cells |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4737 | Stabilizes Baculovirus |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For storage of Baculovirus |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Wash buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride |
| Column cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride |
| Sterile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For Akta Avant cleaning |
References
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