Production et Purification de Baculovirus pour l’Application de la thérapie génique
Summary
Dans ce protocole, baculovirus est produit par transfection transitoire de baculovirus plasmide dans les cellules Sf9 et amplifié dans une culture en suspension sans sérum. Le surnageant est purifié par chromatographie d’affinité de l’héparine et davantage concentré par ultracentrifugation. Ce protocole est utile pour la production et la purification des baculovirus pour l’application de la thérapie génique.
Abstract
Baculovirus a traditionnellement été utilisé pour la production de protéines recombinantes et vaccin. Cependant, plus récemment, les baculovirus émerge comme un vecteur prometteur pour l’application de la thérapie génique. Ici, les baculovirus est produit par transfection transitoire du plasmide baculovirus ADN (bacmid) dans une culture adhérente des cellules Sf9. Baculovirus est étendu par la suite dans les cellules Sf9 dans une culture sans sérum suspension jusqu’à ce que le volume désiré est obtenu. Elle est ensuite purifiée à partir du surnageant à l’aide de la chromatographie d’affinité de l’héparine de culture. Virus surnageant n’est chargé sur la colonne de l’héparine, qui lie les particules de baculovirus dans le surnageant en raison de l’affinité de l’héparine pour baculovirus enveloppent glycoprotéine. La colonne est lavée avec un tampon pour éliminer les contaminants et les baculovirus est éluée de la colonne avec un tampon de haut-sel. L’éluat est dilué à une concentration saline isotonique et particules de baculovirus sont plus concentrés à l’aide d’ultracentrifugation. En utilisant cette méthode, les baculovirus peut être jusqu’à 500 fois concentré avec une reprise de 25 % de particules infectieuses. Bien que le protocole décrit ici illustre la production et la purification de la baculovirus de cultures jusqu’à 1 L, la méthode peut être mise à l’échelle en place dans une culture en suspension système fermé pour produire un vecteur de cliniques de qualité pour l’application de la thérapie génique.
Introduction
Baculovirus est principalement utilisé pour la production de protéines recombinantes et vaccins chez les lépidoptères Spodoptera fugiperda (Sf) 9 cellules d’insectes à l’aide de la recombinaison de virus de la polyédrose nucléaire pourcentage Autographa californica (AcMNPV) 1 , 2 , 3 , 4. plus récemment, il s’impose comme un vecteur prometteur pour la thérapie de gène demande5. Il est connu pour avoir un tropisme hôte et tissu large, infecte les cellules quiescentes et de prolifération, est non pathogène et ne s’intègre pas dans l’hôte du chromosome4,5,6. En outre, baculovirus peuvent être produites en suspension sans sérum qui est évolutif et permet de système fermé de traitement pour la production future clinique1.
La pureté des baculovirus particules est importante pour la réalisation de transduction efficace tout en minimisant la cytotoxicité7,8,9. Baculovirus peuvent être concentrés par ultracentrifugation ou filtration à flux tangentiel (FFT) avec un impact limité sur son infectiosité. Toutefois, ces procédures concentrent non seulement des particules virales, mais aussi les débris cellulaires et les protéines de Sf9 culture, qui peut être toxique en vitro (observation personnelle) et peuvent induire une inflammation ou une réponse immunitaire lorsqu’il est utilisé en vivo. Pour éviter cela, surtout quand utilisant très concentré des stocks de virus, baculovirus infectieuse doit être purifié et séparés des particules de contaminant.
Plusieurs méthodes ont été signalés pour la purification et la concentration de baculovirus vecteurs10,11,12. Parmi les approches disponibles, chromatographie d’affinité de l’héparine permet un niveau élevé seule étape de purification avec la faible concentration de contaminant protéines12. La méthode repose sur l’identification de l’héparane sulfate comme le récepteur de baculovirus13,14. Après le chargement de surnageant de cellules Sf9 sur la colonne et la liaison de baculovirus, la colonne peut être lavée avec un tampon physiologique (isotonique) pour enlever les particules polluantes non liés ou faiblement liés. La liaison à l’héparine étant réversible, les baculovirus particules peuvent être éluées avec un tampon salin haut, qui est dilué immédiatement à la concentration de sel (isotonique) physiologique pour empêcher l’inactivation par choc osmotique,12. En outre, la production de baculovirus, mais aussi capture sur et élution de la colonne de chromatographie, peut être effectuée à l’aide d’un processus de système fermé qui est compatible avec les pratiques actuelles de fabrication (cGMP).
Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la fabrication, purification et concentration de baculovirus infectieuses par centrifugation et chromatographie d’affinité. Brièvement, nous produisons des baculovirus par transfection de cellules Sf9 avec un ADN plasmidique de baculovirus dans culture adhérente et d’élargir davantage le baculovirus infectieux en suspension sans sérum. Nous purifions baculovirus utilisant la chromatographie d’affinité de l’héparine et utiliser ultracentrifugation comme l’étape finale se pour concentrer fortement le vecteur pour l’application de la thérapie génique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole présenté ici décrit la production de baculovirus Sf9 cellules en suspension et de la purification des baculovirus utilisant une chromatographie d’affinité de l’héparine. Les paramètres utilisés dans le présent protocole maximiser le rendement et réduire au minimum l’inactivation de baculovirus infectieuses. Le protocole fourni ici montre qu’une reprise nettement améliorée de baculovirus particules par rapport aux recouvrements obtenus par d’autres9.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est soutenu en partie par le Fonds de démarrage de Cincinnati Children Research Foundation (CPFR) M.N. et innovantes Core Grant (GIC) pris en charge par le Centre National pour l’avancement des Sciences translationnelle de la National Institutes of Health, sous Prix numéro UL1 TR001425. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health.
Materials
| Akta Avant 150 | GE Healthcare | 28976337 | Chromatography system |
| POROS Heparin 50 µm Column | ThermoFisher Scientific | 4333414 | Heparin column |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Non-catalog item | Concentrates virus at high-speed |
| Polyallomer Ultracentrifuge tube | Beckman-Coulter | 326823 | Concentrates virus at high-speed |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| 250 mL Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| 1 L Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238072 | Flask for suspension culture |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of Baculovirus supernatant |
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Tissue culture treated plate |
| 10-cm plate | ThermoFisher Scientific | 08-772E | Tissue culture treated plate |
| Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF | EMD-Millipore | SCHVU05RE | Filtration unit |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | 15160-054 | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| Bac-to-Bac Vector Kit | ThermoFisher Scientific | 10360-014 | Baculovirus expression system |
| DH10B-T1R Competent cell | ThermoFisher Scientific | 12331-013 | Competent cell for bacmid |
| TE buffer | In-house | Non-catalog item | 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0. |
| Plasmid Maxiprep kit | ThermoFisher Scientific | K2100-06 | For bacmid purification |
| Sf9 Cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Grace’s Insect Cell Culture Medium | ThermoFisher Scientific | 11605-094 | Transfection medium |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012227 | Washing cells, diluting samples |
| HyClone SFX-Insect cell media | GE Healthcare | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Baculovirus plasmid (bacmid) DNA | In-house | Non-catalog item | Bacmid for Baculovirus Production |
| Cellfectin II | ThermoFisher Scientific | 10362 | Transfection reagent for insect cells |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4737 | Stabilizes Baculovirus |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For storage of Baculovirus |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Wash buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride |
| Column cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride |
| Sterile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For Akta Avant cleaning |
References
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