Produzione e purificazione di Baculovirus per applicazione di terapia genica
Summary
In questo protocollo, baculovirus è prodotta dalla trasfezione transiente del baculovirus plasmide nelle cellule Sf9 e amplificato in una coltura di sospensione serum-free. Il supernatante è purificato mediante cromatografia di affinità di eparina e ulteriormente concentrato mediante ultracentrifugazione. Questo protocollo è utile per la produzione e purificazione di baculovirus per applicazione di terapia genica.
Abstract
Baculovirus è stato tradizionalmente utilizzato per la produzione di proteine ricombinanti e vaccino. Tuttavia, più recentemente, baculovirus sta emergendo come un vettore promettente per applicazioni di terapia genica. Qui, baculovirus è prodotto dalla trasfezione transiente del baculovirus plasmide DNA (bacmid) in una coltura aderente delle cellule Sf9. Baculovirus è successivamente ampliato in Sf9 cellule in una coltura di sospensione serum-free fino ad ottenuta il volume desiderato. Viene quindi purificata dal surnatante mediante cromatografia di affinità di eparina della cultura. Surnatante virus viene caricato sulla colonna di eparina che lega le particelle baculovirus nel surnatante a causa dell’affinità di eparina per baculovirus avvolgono glicoproteina. La colonna viene lavata con un tampone per rimuovere i contaminanti e baculovirus è eluiti dalla colonna con un buffer del alto-sale. L’eluato viene diluito ad una concentrazione salina isotonica e particelle di baculovirus sono ulteriormente concentrato mediante ultracentrifugazione. Utilizzando questo metodo, baculovirus può essere concentrato fino a 500-fold con un 25% di recupero di particelle infettive. Sebbene il protocollo descritto qui di seguito viene illustrato la produzione e purificazione del baculovirus da culture fino a 1 L, il metodo possa essere scalati fino in una cultura di sospensione sistema chiuso per la produzione di un vettore di uso clinico per applicazione di terapia genica.
Introduction
Baculovirus è utilizzata principalmente per la produzione di proteine ricombinanti e vaccini in lepidottero Spodoptera fugiperda (Sf) 9 cellule di insetto utilizzando ricombinante virus di virus della poliedrosi nucleare di Autographa californica (AcMNPV) 1 , 2 , 3 , 4. più di recente, sta emergendo come un vettore promettente per la terapia genica applicazione5. Esso è noto per avere un ampio tropismo host e tessuto, infetta le cellule proliferanti sia quiescente, è non patogeni e non integrare l’host del cromosoma4,5,6. Inoltre, baculovirus può essere prodotto nella coltura di sospensione serum-free che è scalabile e consente per sistema chiuso di elaborazione per la futura produzione clinica1.
La purezza del baculovirus particelle è importante per il raggiungimento di trasduzione efficace riducendo al minimo la citotossicità7,8,9. Baculovirus possono essere concentrati di ultracentrifugazione o filtrazione a flusso tangenziale (TFF) con impatto limitato sulla sua infettività. Tuttavia, queste procedure non solo concentrano le particelle del virus ma anche detriti cellulari e proteine da Sf9 cultura, che può essere tossico in vitro (osservazione personale) e possono indurre l’infiammazione o una risposta immunitaria quando utilizzato in vivo. Per evitare questo, soprattutto quando utilizzando altamente concentrato scorte di virus, baculovirus infettivi deve essere purificato e separati da particelle contaminanti.
Diversi metodi sono stati segnalati per la purificazione e la concentrazione di baculovirus vettori10,11,12. Degli approcci disponibili, cromatografia di affinità di eparina consente un elevato livello di singolo-passaggio di purificazione con la bassa concentrazione di contaminanti proteine12. Il metodo si basa sull’identificazione del solfato di heparan come il recettore per baculovirus13,14. Dopo il caricamento Sf9 surnatante di cella nella colonna e associazione di baculovirus, la colonna può essere lavata con fisiologica (isotonica) buffer per rimuovere particelle contaminanti vagamente associate o non associate. Poiché l’associazione di eparina è rovesciabile, baculovirus particelle possono essere eluite con un tampone salino elevato, che è immediatamente diluito alla concentrazione fisiologica di sale (isotonica) per evitare che l’inattivazione di shock osmotico12. Inoltre, la produzione di baculovirus, nonché acquisizione su e l’eluizione dalla colonna cromatografia, può essere eseguita utilizzando un processo di sistema chiuso che è compatibile con le attuali pratiche di buona fabbricazione (cGMP).
Qui, forniamo un protocollo dettagliato per la fabbricazione, la purificazione e la concentrazione di baculovirus infettivi mediante centrifugazione e cromatografia di affinità. Brevemente, produciamo baculovirus mediante trasfezione di cellule Sf9 con un DNA plasmidico baculovirus nella cultura aderente e ampliare ulteriormente il baculovirus infettivi nella coltura di sospensione serum-free. Dobbiamo purificare baculovirus mediante cromatografia di affinità di eparina e usare ultracentrifugazione come il passaggio finale per altamente concentrato il vettore per applicazione di terapia genica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo presentato qui descrive la produzione di baculovirus in Sf9 cellule in coltura in sospensione e purificazione di baculovirus utilizzando una cromatografia di affinità di eparina. I parametri utilizzati in questo protocollo massimizzare il rendimento e ridurre al minimo l’inattivazione di baculovirus infettivi. Il protocollo fornito qui indica che un recupero significativamente migliorato di baculovirus particelle rispetto ai recuperi realizzato da altri9.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è sostenuto in parte attraverso il finanziamento di Start-up da di Cincinnati Children ‘ s Research Foundation (CCRF) a M.N. e innovativo Core Grant (ICG) supportato dal centro nazionale per le scienze traslazionale avanzando dei National Institutes of Health, sotto Premio numero UL1 TR001425. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.
Materials
| Akta Avant 150 | GE Healthcare | 28976337 | Chromatography system |
| POROS Heparin 50 µm Column | ThermoFisher Scientific | 4333414 | Heparin column |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Non-catalog item | Concentrates virus at high-speed |
| Polyallomer Ultracentrifuge tube | Beckman-Coulter | 326823 | Concentrates virus at high-speed |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| 250 mL Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| 1 L Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238072 | Flask for suspension culture |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of Baculovirus supernatant |
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Tissue culture treated plate |
| 10-cm plate | ThermoFisher Scientific | 08-772E | Tissue culture treated plate |
| Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF | EMD-Millipore | SCHVU05RE | Filtration unit |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | 15160-054 | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| Bac-to-Bac Vector Kit | ThermoFisher Scientific | 10360-014 | Baculovirus expression system |
| DH10B-T1R Competent cell | ThermoFisher Scientific | 12331-013 | Competent cell for bacmid |
| TE buffer | In-house | Non-catalog item | 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0. |
| Plasmid Maxiprep kit | ThermoFisher Scientific | K2100-06 | For bacmid purification |
| Sf9 Cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Grace’s Insect Cell Culture Medium | ThermoFisher Scientific | 11605-094 | Transfection medium |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012227 | Washing cells, diluting samples |
| HyClone SFX-Insect cell media | GE Healthcare | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Baculovirus plasmid (bacmid) DNA | In-house | Non-catalog item | Bacmid for Baculovirus Production |
| Cellfectin II | ThermoFisher Scientific | 10362 | Transfection reagent for insect cells |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4737 | Stabilizes Baculovirus |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For storage of Baculovirus |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Wash buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride |
| Column cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride |
| Sterile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For Akta Avant cleaning |
References
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