Summary

Herstellung und Reinigung des Baculovirus für Gentherapie Anwendung

Published: April 09, 2018
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Summary

In diesem Protokoll wird Baculovirus von Transiente Transfektion von Baculovirus Plasmid in Sf9 Zellen produziert und verstärkt in serumfreien SUSPENSIONSKULTUR. Der Überstand wird durch Heparin Affinitätschromatographie gereinigt und weiter durch Ultrazentrifugation konzentriert. Dieses Protokoll eignet sich für die Herstellung und Reinigung des Baculovirus für Gen-Therapie Anwendung.

Abstract

Baculovirus wurde traditionell für die Produktion von rekombinanten Proteinen und Impfstoff eingesetzt worden. Allerdings ist vor kurzem Baculovirus als vielversprechende Vektor für Gen-Therapie-Anwendung entstehen. Hier entsteht Baculovirus durch Transiente Transfektion von Baculovirus Plasmid DNA (Bacmid) in einer haftfesten Kultur Sf9 Zellen. Baculovirus wird anschließend in Sf9 Zellen in serumfreien SUSPENSIONSKULTUR erweitert, bis das gewünschte Volumen erreicht ist. Es wird dann von der Kultur überstand mit Heparin Affinitätschromatographie gereinigt. Virus Überstand wird auf die Heparin-Spalte die Baculovirus Partikel im überstand aufgrund der Affinität von Heparin bindet, denn Baculovirus Glykoprotein umhüllen geladen. Die Spalte wird gewaschen, mit einem Puffer um Verunreinigungen zu entfernen und Baculovirus ist aus der Spalte mit einem hohem Salzgehalt Puffer eluiert. Das Eluat wird verdünnt, um eine isotonische Salzkonzentration und Baculovirus Partikel sind weitere Verwendung Ultrazentrifugation konzentriert. Mit dieser Methode können Baculovirus bis zu 500-fold mit einer 25 % Erholung der infektiöse Partikel konzentriert werden. Obwohl das hier beschriebene Protokoll die Herstellung und Reinigung von der Baculovirus aus Kulturen bis zu 1 L zeigt, die Methode kann in ein geschlossenes System SUSPENSIONSKULTUR, klinische Grade Vektor für Gen-Therapie-Anwendung zu produzieren Aufstockung werden.

Introduction

Baculovirus dient in erster Linie für die Produktion von rekombinanten Proteinen und Impfstoffe in Lepidopteran Spodoptera Fugiperda (Sf) 9 Insektenzellen mittels rekombinanter Autographa Californica multicapsid nuklearen Polyhedrosis Virus (AcMNPV) 1 , 2 , 3 , 4. vor kurzem, es erweist sich als eine vielversprechende Vektor für Gen-Therapie Anwendung5. Es ist bekannt, dass eine breite Host und Gewebe Tropismus, Ruhestrom und wuchernde Zellen infiziert ist apathogen und integriert nicht in die Host-Chromosom4,5,6. Darüber hinaus können Baculovirus in serumfreien SUSPENSIONSKULTUR hergestellt werden, die ist skalierbar und geschlossenes System für zukünftige klinische Produktion1Verarbeitung ermöglicht.

Die Reinheit des Baculovirus Partikel ist wichtig zur Erreichung effektiven Transduktion bei gleichzeitiger Minimierung der Zytotoxizität7,8,9. Baculovirus können durch Ultrazentrifugation oder tangential-Flow Filtration (TFF) mit geringen Auswirkungen auf seine Infektiosität konzentriert werden. Diese Verfahren nicht nur konzentrieren Viruspartikel aber auch zelltrümmer und Proteine aus Sf9 können induzieren Entzündungen oder eine Immunantwort bei Kultur, die giftige in Vitro (persönliche Beobachtung) kann in Vivo. Um dies zu vermeiden, vor allem, wenn mit Virus Aktien konzentriert, muss infektiöse Baculovirus gereinigt und von kontaminierenden Partikel getrennt werden.

Verschiedene Methoden wurden für die Reinigung und Konzentration der Baculovirus Vektoren10,11,12berichtet. Von den verfügbaren Ansätzen ermöglicht Heparin Affinitätschromatographie Einzelschritt hohem Niveau der Reinigung mit der niedrigen Konzentration der kontaminierende Proteine12. Die Methode basiert auf der Identifikation des Heparan Sulfat als Rezeptor für Baculovirus13,14. Nach dem Laden Sf9 Zelle überstand auf die Spalte und die Bindung des Baculovirus, waschbar die Spalte mit physiologischen (Isotone) Puffer ungebunden oder lose gebundenen verunreinigende Partikel zu entfernen. Da die Bindung an Heparin umkehrbar ist, können Baculovirus Partikel mit einem hohen Salz Puffer eluiert die physiologischen (Isotone) Salzkonzentration zu verhindern, dass die Inaktivierung durch osmotischen Schock12sofort verdünnt wird. Darüber hinaus kann die Produktion von Baculovirus sowie Erfassung auf und Elution von der Chromatographiesäule erfolgen über ein geschlossenes System-Prozess, der mit aktuellen gute Herstellungspraxis (cGMP) kompatibel ist.

Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zur Herstellung, Reinigung und Konzentration von infektiösen Baculovirus mittels Affinitätschromatographie und Zentrifugieren. Kurz, wir produzieren Baculovirus durch Transfektion von Sf9 Zellen mit einem Baculovirus Plasmid DNA in adhärenten Kultur und die infektiöse Baculovirus in serumfreien SUSPENSIONSKULTUR weiter ausbauen. Wir reinigen mit Heparin Affinitätschromatographie Baculovirus und mit Ultrazentrifugation als letzten Schritt hoch den Vektor für Gen-Therapie-Anwendung konzentrieren.

Protocol

Siehe Abbildung 1 zur Veranschaulichung einer Zusammenfassung des Protokolls. 1. Reinigung des Baculovirus Plasmid DNA Bakterienkultur mit Baculoviral Plasmid DNA (Bacmid)14 in 200 mL LB-Brühe mit Antibiotika zu wachsen; Kanamycin (50 µg/mL), Tetracyclin (10 µg/mL) und Gentamycin (7 µg/mL), 16 h bei 37 ° C auf einem Orbitalschüttler Einstellung bei 300 Umdrehungen pro Minute. Reinigen der Bacmid DNA aus der Bakteri…

Representative Results

Das Protokoll dargestellt ist in einem Flussdiagramm (Abbildung 1). Schritte umfassen die Transiente Transfektion von Sf9 Zellen mit Bacmid DNA Baculovirus anhaftende Kultur in einer Platte, die spätere Verstärkung in serumfreien SUSPENSIONSKULTUR, Nuklease Behandlung und Klärung durch Zentrifugation und Filtration herstellen, und die Reinigung mit der Heparin-Affinitätschromatographie gefolgt von Konzentration mit Ultrazentrifugation. <p class="jove_…

Discussion

Die hier vorgestellten Protokoll beschreibt die Herstellung von Baculovirus in Sf9 Zellen in SUSPENSIONSKULTUR und Reinigung des Baculovirus mit einem Heparin-Affinitätschromatographie. Die Parameter, die in diesem Protokoll verwendeten den Ertrag maximieren und minimieren die Inaktivierung von infektiösen Baculovirus. Das Protokoll zur Verfügung gestellt hier zeigt, dass eine deutlich verbesserte Regeneration Baculovirus Teilchen im Vergleich zu Rückforderungen von anderen9erreicht.

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Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wird teilweise unterstützt durch die Anschubfinanzierung von Cincinnati Children Research Foundation (CCRF) M.N und Innovative Core Grant (ICG) unterstützt durch die nationale Mitte für voran Translational Wissenschaft von den National Institutes of Health unter Award Nr. UL1 TR001425. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.

Materials

Akta Avant 150 GE Healthcare 28976337 Chromatography system
POROS Heparin 50 µm Column ThermoFisher Scientific 4333414 Heparin column
Ultracentrifuge Beckman-Coulter Non-catalog item Concentrates virus at high-speed
Polyallomer Ultracentrifuge tube Beckman-Coulter 326823 Concentrates virus at high-speed
MaxQ 8000 orbital shaker incubator  ThermoFisher Scientific Non-catalog item Shaker for suspension culture
250 mL Erlenmeyer flasks ThermoFisher Scientific 238071 Flask for suspension culture
1 L Erlenmeyer flasks ThermoFisher Scientific 238072 Flask for suspension culture
Microscope (Olympus CKX41) Olympus Non-catalog item Cell monitoring and counting 
Table top centrifuge ThermoFisher Scientific 75253839/433607 For clarification of Baculovirus supernatant
50 ml Conical tube ThermoFisher Scientific 14-959-49A For collection of Baculovirus supernatant
6-well plate ThermoFisher Scientific 07-200-80 Tissue culture treated plate
10-cm plate ThermoFisher Scientific 08-772E Tissue culture treated plate
Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF EMD-Millipore SCHVU05RE Filtration unit
Kanamycin ThermoFisher Scientific 15160-054
Tetracycline Sigma-Aldrich T7660
Gentamycin ThermoFisher Scientific 15750-060
Bac-to-Bac Vector Kit ThermoFisher Scientific 10360-014 Baculovirus expression system
DH10B-T1R  Competent cell ThermoFisher Scientific 12331-013 Competent cell for bacmid
TE buffer In-house Non-catalog item 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0.
Plasmid Maxiprep kit ThermoFisher Scientific K2100-06 For bacmid purification
Sf9 Cells ThermoFisher Scientific 11496-015 Insect cells
Grace’s Insect Cell Culture Medium ThermoFisher Scientific 11605-094 Transfection medium
PBS ThermoFisher Scientific 20012227 Washing cells, diluting samples
HyClone SFX-Insect cell media GE Healthcare SH30278.02 Serum-free insect cell growth medium
Benzonase Nuclease Sigma-Aldrich E1014 Enzyme to degrade DNA and RNA
Baculovirus plasmid (bacmid) DNA In-house Non-catalog item Bacmid for Baculovirus Production
Cellfectin II  ThermoFisher Scientific 10362 Transfection reagent for insect cells
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4737 Stabilizes Baculovirus
Cryovial Thomas Scientific 1222C24 For storage of Baculovirus
HT1080 cell line ATCC CCL-121 Fibroblast cell line
DMEM Sigma-Aldrich D6429 Growth media for cell lines
Wash buffer In-house Non-catalog item 20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride
Elution buffer In-house Non-catalog item 20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride
Column cleaning buffer In-house Non-catalog item 20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride
Sterile water In-house Non-catalog item For Akta Avant cleaning
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 1.09137 For Akta Avant cleaning
Ethanol Sigma-Aldrich E7073 For Akta Avant cleaning

References

  1. Ikonomou, L., Schneider, Y. J., Agathos, S. N. Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins. Appl Microbiol Biotechnol. 62 (1), 1-20 (2003).
  2. Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
  3. Cox, M. M. Recombinant protein vaccines produced in insect cells. Vaccine. 30 (10), 1759-1766 (2012).
  4. Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (6), 2348-2352 (1996).
  5. Airenne, K. J., et al. Baculovirus: an insect-derived vector for diverse gene transfer applications. Mol Ther. 21 (4), 739-749 (2013).
  6. Sung, L. Y., et al. Efficient gene delivery into cell lines and stem cells using baculovirus. Nat Protoc. 9 (8), 1882-1899 (2014).
  7. Zeng, J., Du, J., Lin, J., Bak, X. Y., Wu, C., Wang, S. High-efficiency transient transduction of human embryonic stem cell-derived neurons with baculoviral vectors. Mol Ther. 17 (9), 1585-1593 (2009).
  8. Zeng, J., Du, J., Zhao, Y., Palanisamy, N., Wang, S. Baculoviral vector-mediated transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25 (4), 1055-1061 (2007).
  9. Wu, C., Soh, K. Y., Wang, S. Ion-exchange membrane chromatography method for rapid and efficient purification of recombinant baculovirus and baculovirus gp64 protein. Hum Gene Ther. 18 (7), 665-672 (2007).
  10. Grein, T. A., Michalsky, R., Vega Lopez, M., Czermak, P. Purification of a recombinant baculovirus of Autographa californica M nucleopolyhedrovirus by ion exchange membrane chromatography. J Virol Methods. 183 (2), 117-124 (2012).
  11. Nasimuzzaman, M., Lynn, D., van der Loo, J. C., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16071 (2016).
  12. Makkonen, K. E., Turkki, P., Laakkonen, J. P., Yla-Herttuala, S., Marjomaki, V., Airenne, K. J. 6-o- and N-sulfated syndecan-1 promotes baculovirus binding and entry into Mammalian cells. J Virol. 87 (20), 11148-11159 (2013).
  13. Nasimuzzaman, M. Heparan sulfate in baculovirus binding and entry of mammalian cells. J Virol. 88 (8), 4607-4608 (2014).
  14. Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. J Virol. 80 (4), 1874-1885 (2006).
  15. Feliciello, I., Chinali, G. A modified alkaline lysis method for the preparation of highly purified plasmid DNA from Escherichia coli. Anal Biochem. 212 (2), 394-401 (1993).
  16. Nasimuzzaman, M., Persons, D. A. Cell Membrane-associated heparan sulfate is a receptor for prototype foamy virus in human, monkey, and rodent cells. Mol Ther. 20 (6), 1158-1166 (2012).
  17. Earl, P. L., Americo, J. L., Moss, B. Development and use of a vaccinia virus neutralization assay based on flow cytometric detection of green fluorescent protein. J Virol. 77 (19), 10684-10688 (2003).
  18. Kim, Y. K., et al. Suppression of tumor growth in xenograft model mice by programmed cell death 4 gene delivery using folate-PEG-baculovirus. Cancer Gene Ther. 17 (11), 751-760 (2010).
  19. Stanbridge, L. J., Dussupt, V., Maitland, N. J. Baculoviruses as vectors for gene therapy against human prostate cancer. J Biomed Biotechnol. 2003 (2), 79-91 (2003).
  20. Nasimuzzaman, M., et al. Production and purification of high-titer foamy virus vector for the treatment of leukocyte adhesion deficiency. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16004 (2015).

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Citer Cet Article
Nasimuzzaman, M., van der Loo, J. C., Malik, P. Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application. J. Vis. Exp. (134), e57019, doi:10.3791/57019 (2018).

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