Summary

Production et Purification de Baculovirus pour l’Application de la thérapie génique

Published: April 09, 2018
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Summary

Dans ce protocole, baculovirus est produit par transfection transitoire de baculovirus plasmide dans les cellules Sf9 et amplifié dans une culture en suspension sans sérum. Le surnageant est purifié par chromatographie d’affinité de l’héparine et davantage concentré par ultracentrifugation. Ce protocole est utile pour la production et la purification des baculovirus pour l’application de la thérapie génique.

Abstract

Baculovirus a traditionnellement été utilisé pour la production de protéines recombinantes et vaccin. Cependant, plus récemment, les baculovirus émerge comme un vecteur prometteur pour l’application de la thérapie génique. Ici, les baculovirus est produit par transfection transitoire du plasmide baculovirus ADN (bacmid) dans une culture adhérente des cellules Sf9. Baculovirus est étendu par la suite dans les cellules Sf9 dans une culture sans sérum suspension jusqu’à ce que le volume désiré est obtenu. Elle est ensuite purifiée à partir du surnageant à l’aide de la chromatographie d’affinité de l’héparine de culture. Virus surnageant n’est chargé sur la colonne de l’héparine, qui lie les particules de baculovirus dans le surnageant en raison de l’affinité de l’héparine pour baculovirus enveloppent glycoprotéine. La colonne est lavée avec un tampon pour éliminer les contaminants et les baculovirus est éluée de la colonne avec un tampon de haut-sel. L’éluat est dilué à une concentration saline isotonique et particules de baculovirus sont plus concentrés à l’aide d’ultracentrifugation. En utilisant cette méthode, les baculovirus peut être jusqu’à 500 fois concentré avec une reprise de 25 % de particules infectieuses. Bien que le protocole décrit ici illustre la production et la purification de la baculovirus de cultures jusqu’à 1 L, la méthode peut être mise à l’échelle en place dans une culture en suspension système fermé pour produire un vecteur de cliniques de qualité pour l’application de la thérapie génique.

Introduction

Baculovirus est principalement utilisé pour la production de protéines recombinantes et vaccins chez les lépidoptères Spodoptera fugiperda (Sf) 9 cellules d’insectes à l’aide de la recombinaison de virus de la polyédrose nucléaire pourcentage Autographa californica (AcMNPV) 1 , 2 , 3 , 4. plus récemment, il s’impose comme un vecteur prometteur pour la thérapie de gène demande5. Il est connu pour avoir un tropisme hôte et tissu large, infecte les cellules quiescentes et de prolifération, est non pathogène et ne s’intègre pas dans l’hôte du chromosome4,5,6. En outre, baculovirus peuvent être produites en suspension sans sérum qui est évolutif et permet de système fermé de traitement pour la production future clinique1.

La pureté des baculovirus particules est importante pour la réalisation de transduction efficace tout en minimisant la cytotoxicité7,8,9. Baculovirus peuvent être concentrés par ultracentrifugation ou filtration à flux tangentiel (FFT) avec un impact limité sur son infectiosité. Toutefois, ces procédures concentrent non seulement des particules virales, mais aussi les débris cellulaires et les protéines de Sf9 culture, qui peut être toxique en vitro (observation personnelle) et peuvent induire une inflammation ou une réponse immunitaire lorsqu’il est utilisé en vivo. Pour éviter cela, surtout quand utilisant très concentré des stocks de virus, baculovirus infectieuse doit être purifié et séparés des particules de contaminant.

Plusieurs méthodes ont été signalés pour la purification et la concentration de baculovirus vecteurs10,11,12. Parmi les approches disponibles, chromatographie d’affinité de l’héparine permet un niveau élevé seule étape de purification avec la faible concentration de contaminant protéines12. La méthode repose sur l’identification de l’héparane sulfate comme le récepteur de baculovirus13,14. Après le chargement de surnageant de cellules Sf9 sur la colonne et la liaison de baculovirus, la colonne peut être lavée avec un tampon physiologique (isotonique) pour enlever les particules polluantes non liés ou faiblement liés. La liaison à l’héparine étant réversible, les baculovirus particules peuvent être éluées avec un tampon salin haut, qui est dilué immédiatement à la concentration de sel (isotonique) physiologique pour empêcher l’inactivation par choc osmotique,12. En outre, la production de baculovirus, mais aussi capture sur et élution de la colonne de chromatographie, peut être effectuée à l’aide d’un processus de système fermé qui est compatible avec les pratiques actuelles de fabrication (cGMP).

Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la fabrication, purification et concentration de baculovirus infectieuses par centrifugation et chromatographie d’affinité. Brièvement, nous produisons des baculovirus par transfection de cellules Sf9 avec un ADN plasmidique de baculovirus dans culture adhérente et d’élargir davantage le baculovirus infectieux en suspension sans sérum. Nous purifions baculovirus utilisant la chromatographie d’affinité de l’héparine et utiliser ultracentrifugation comme l’étape finale se pour concentrer fortement le vecteur pour l’application de la thérapie génique.

Protocol

Voir la Figure 1 pour une illustration Résumé du protocole. 1. purification d’ADN plasmidique Baculovirus Cultiver la culture bactérienne contenant baculoviral plasmide ADN (bacmid)14 dans 200 mL de bouillon LB avec des antibiotiques ; kanamycine (50 µg/mL), tétracycline (10 µg/mL) et gentamicine (7 µg/mL), de 16 h à 37 ° C sur un réglage de l’agitateur orbital à 300 tr/min. Purifier l’ADN de bacmid de …

Representative Results

Le protocole présenté est dans un schéma (Figure 1). Les étapes incluent la transfection transitoire des cellules Sf9 avec bacmid l’ADN pour produire des baculovirus dans culture adhérente dans une assiette, l’amplification ultérieure en culture en suspension sans sérum, traitement nucléase et clarification par centrifugation et filtration, et la purification en utilisant la chromatographie d’affinité de l’héparine suivi de concentration ave…

Discussion

Le protocole présenté ici décrit la production de baculovirus Sf9 cellules en suspension et de la purification des baculovirus utilisant une chromatographie d’affinité de l’héparine. Les paramètres utilisés dans le présent protocole maximiser le rendement et réduire au minimum l’inactivation de baculovirus infectieuses. Le protocole fourni ici montre qu’une reprise nettement améliorée de baculovirus particules par rapport aux recouvrements obtenus par d’autres9.

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Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail est soutenu en partie par le Fonds de démarrage de Cincinnati Children Research Foundation (CPFR) M.N. et innovantes Core Grant (GIC) pris en charge par le Centre National pour l’avancement des Sciences translationnelle de la National Institutes of Health, sous Prix numéro UL1 TR001425. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health.

Materials

Akta Avant 150 GE Healthcare 28976337 Chromatography system
POROS Heparin 50 µm Column ThermoFisher Scientific 4333414 Heparin column
Ultracentrifuge Beckman-Coulter Non-catalog item Concentrates virus at high-speed
Polyallomer Ultracentrifuge tube Beckman-Coulter 326823 Concentrates virus at high-speed
MaxQ 8000 orbital shaker incubator  ThermoFisher Scientific Non-catalog item Shaker for suspension culture
250 mL Erlenmeyer flasks ThermoFisher Scientific 238071 Flask for suspension culture
1 L Erlenmeyer flasks ThermoFisher Scientific 238072 Flask for suspension culture
Microscope (Olympus CKX41) Olympus Non-catalog item Cell monitoring and counting 
Table top centrifuge ThermoFisher Scientific 75253839/433607 For clarification of Baculovirus supernatant
50 ml Conical tube ThermoFisher Scientific 14-959-49A For collection of Baculovirus supernatant
6-well plate ThermoFisher Scientific 07-200-80 Tissue culture treated plate
10-cm plate ThermoFisher Scientific 08-772E Tissue culture treated plate
Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF EMD-Millipore SCHVU05RE Filtration unit
Kanamycin ThermoFisher Scientific 15160-054
Tetracycline Sigma-Aldrich T7660
Gentamycin ThermoFisher Scientific 15750-060
Bac-to-Bac Vector Kit ThermoFisher Scientific 10360-014 Baculovirus expression system
DH10B-T1R  Competent cell ThermoFisher Scientific 12331-013 Competent cell for bacmid
TE buffer In-house Non-catalog item 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0.
Plasmid Maxiprep kit ThermoFisher Scientific K2100-06 For bacmid purification
Sf9 Cells ThermoFisher Scientific 11496-015 Insect cells
Grace’s Insect Cell Culture Medium ThermoFisher Scientific 11605-094 Transfection medium
PBS ThermoFisher Scientific 20012227 Washing cells, diluting samples
HyClone SFX-Insect cell media GE Healthcare SH30278.02 Serum-free insect cell growth medium
Benzonase Nuclease Sigma-Aldrich E1014 Enzyme to degrade DNA and RNA
Baculovirus plasmid (bacmid) DNA In-house Non-catalog item Bacmid for Baculovirus Production
Cellfectin II  ThermoFisher Scientific 10362 Transfection reagent for insect cells
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4737 Stabilizes Baculovirus
Cryovial Thomas Scientific 1222C24 For storage of Baculovirus
HT1080 cell line ATCC CCL-121 Fibroblast cell line
DMEM Sigma-Aldrich D6429 Growth media for cell lines
Wash buffer In-house Non-catalog item 20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride
Elution buffer In-house Non-catalog item 20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride
Column cleaning buffer In-house Non-catalog item 20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride
Sterile water In-house Non-catalog item For Akta Avant cleaning
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 1.09137 For Akta Avant cleaning
Ethanol Sigma-Aldrich E7073 For Akta Avant cleaning

References

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Citer Cet Article
Nasimuzzaman, M., van der Loo, J. C., Malik, P. Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application. J. Vis. Exp. (134), e57019, doi:10.3791/57019 (2018).

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