Подготовка Ломтики свежих сетчатки от взрослых рыбок данио для Ex Vivo изображений эксперименты
Summary
Визуализации тканей сетчатки может предоставить информацию одной ячейки, которые не могут быть собраны от традиционных биохимических методов. Этот протокол описывает подготовка конфокальная томография сетчатки кусочки от данио рерио. Флуоресцентный генетически закодированный датчики или индикатор красители позволяют визуализации многочисленных биологических процессов в типах различных клеток сетчатки.
Abstract
Сетчатка является сложной ткани, которая инициирует и интегрирует первые шаги видения. Дисфункция клеток сетчатки является отличительной чертой многих ослепительный заболеваний, и будущее терапии зависят от основных договоренностей о как различные сетчатки, что клетки нормально функционировать. Получение такой информации с биохимическими методами оказалось сложным делом, потому что вклад конкретной ячейке типов уменьшаются в обстановке клеток сетчатки. Живой сетчатки изображений может предоставить представление многочисленных биологических процессов на субклеточном уровне, благодаря растущее количество генетически закодированный флуоресцентные биодатчиков. Однако этот метод до настоящего времени была ограничена головастиков и личинки данио рерио, внешнего слоев сетчатки изолированных сетчатки или ниже резолюции томография сетчатки в живых животных. Здесь мы представляем метод для создания живых ex vivo сетчатки фрагменты из взрослых рыбок данио для живых изображений через confocal микроскопии. Эта подготовка дает поперечные срезы со всех слоев сетчатки и большинство типов клеток, видимые для выполнения конфокальный изображений эксперименты с использованием перфузии. Трансгенные данио рерио выражая флуоресцентные белки или биодатчики в типы конкретных сетчатки клетки или органеллы используются для извлечения информации одной ячейки из нетронутыми сетчатки. Кроме того фрагменты сетчатки могут быть загружены с флуоресцентный индикатор красители, Добавление метода универсальность. Этот протокол был разработан для визуализации Ca2 + в zebrafish конус фоторецепторов, но с надлежащей маркеры могут быть адаптированы для измерения Ca2 + или метаболитов в клетки Мюллер, биполярных и горизонтальные клетки, микроглии, Амакриновые клетки или сетчатки клетках ганглия. Пигментный эпителий сетчатки удаляется из кусочков, поэтому этот метод не подходит для изучения этого типа ячейки. С практикой это возможно для создания последовательных фрагментов из одного животного для нескольких экспериментов. Эта адаптируемых техника предоставляет мощный инструмент для ответа на многие вопросы о биологии клетки сетчатки, Ca2 +и энергетического гомеостаза.
Introduction
Данио рерио (Danio рерио) стала широко используется в медицинской и базовые научные исследования1, из-за ее небольшого размера, быстрое развитие и позвоночных органов и систем. Естественный прозрачности данио рерио личинок в сочетании с установленными методами для трансгенез позволили подробные визуализации клеточных процессов в живых животных. Количество генетически закодированный флуоресцентные биодатчики были направлены конкретные данио рерио клеток, чтобы обнаружить Ca2 + 2, перекись водорода3, apoptotic активации4 и5СПС.
В естественных условиях изображений данио рерио личинок привела к открытий в области неврологии, включая картирование мозга цепь6 и разработки лекарств для центральной нервной системы расстройств7. Данио рерио хорошо подходят для видения исследований, потому что их сетчатки располагают слоистые структуры и типы нейрон высших позвоночных животных, и они отображают надежного визуального поведения8,9. Несколько типов сетчатки дегенерации аналогичных болезней человека были смоделированы успешно и учился в zebrafish10,11, включая живые изображения отдельных фоторецепторов, вырождающихся в сетчатке2, 12.
В то время как в естественных условиях личиночной данио рерио изображений является ценным инструментом, он становится более сложным, как рыба расти и развиваться пигментации, и некоторые фармакологические методы лечения не могут пронизывать весь животного. Кроме того некоторые клеточные процессы изменения с развитием и возраст, делая позднее время очков важна для понимания функций и прогрессирование болезни у взрослых животных. Биохимические методы, такие как immunoblot, quantitiative ПЦР, O2 потребления и Метаболомные анализов может обеспечить важные подсказки о биологии сетчатки в целом, но это трудно различить взносов типов отдельных клеток, пострадавших от болезни. Imaging изолированных ткани сетчатки ex vivo обходит эти проблемы и хотя плоских изображений навесные сетчатки открывается вид наружной сетчатки13, глубже внутренний сетчатки особенности скрываются. Поперечная сетчатки ломтиками, такие, как те, которые представлены в фиксированной Иммуногистохимический анализ, дать четкое представление о всех слоев и типов клеток, но предлагают только один моментальный снимок динамических процессов, участвующих в нормальной функции и болезней.
Здесь мы представляем метод для генерации ex vivo поперечной сетчатки фрагменты из взрослых рыбок данио для изображений. Он похож на методы подготовки амфибий и данио рерио сетчатки ломтиками для электрофизиологических и морфологических исследований14,15, с важными изменениями для визуализации ex vivo с помощью конфокальной промежуток времени микроскопия. Флуоресценции ответы биодатчики или красителей в ломтики контролируются в режиме реального времени с Конфокальный микроскоп пока поставляющ фармакологических агентов с помощью перфузии. В то время как метод был разработан для визуализации фоторецепторов, это может быть целесообразно использовать для визуализации ячеек, биполярных клеток, горизонтальные клетки, Амакриновые клетки или клетки сетчатки ганглия Мюллер с соответствующим флуоресцентные маркеры. Кроме того фрагменты могут быть загружены с люминесцентными красками клеток проницаемой для отчета жизнеспособности клеток, везикулярный транспорт, митохондриальной функции или окислительно-восстановительного состояния. Этот универсальный препарат позволяет визуализировать широкий спектр внутриклеточных процессов на протяжении всего сетчатки, включая Ca2 + динамика, сигнала и метаболических состояние.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ex vivo томография сетчатки Ломтики свежих данио рерио оказался универсальный инструмент для изучения фоторецепторных биологии20,21,22и является уникальным в том, что он позволяет анализ единичных клеток в зрелых, полностью дифференц?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Ральф Нельсон и Daniel Possin для продуманного руководства при разработке этот протокол и Eva мА, Эшли Джордж и Гэйл Стэнтон для формирования стабильных данио рерио трансгенных линий. Работа была поддержана NSF GRFP 2013158531 для м.г., низ NEI 5T32EY007031 туалетное и м.г. и EY026020 J.H. и с.б.
Materials
| zebrafish | Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility | stocks maintained in-house as stable transgenic lines | |
| petroleum jelly | Fisher Scientific | 19-090-843 | for petroleum jelly syringe |
| 3-mL slip tip syringe | Fisher Scientific | 14-823-436 | for petroleum jelly syringe |
| 20g 3.8 cm slip tip needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | for petroleum jelly syringe |
| plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for eyecup dissection, slicing chamber |
| Seche Vite clear nail polish | Amazon | B00150LT40 | for slicing chamber |
| 18 mm X 18 mm #1 glass coverslips | Fisher Scientific | 12-542A | for imaging ladders |
| unflavored dental wax | Amazon | B01K8WNL5A | for imaging ladders |
| double edge razor blades | Stoelting | 51427 | for tissue slicing |
| tissue slicer with digital micrometer | Stoelting | 51415 | for tissue slicing |
| filter paper – white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 µm pore size | EMD Millipore | HAWG01300 | filter paper for mounting retinas |
| 10 cm petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly |
| 15 cm plain-tipped wood applicator stick | Fisher Scientific | 23-400-112 | for wire eye loop tool |
| 30g (0.25 mm diameter) tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | for wire eye loop tool |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G8270 | component of supplement stock solution |
| sodium L-lactate | Sigma Aldrich | L7022 | component of supplement stock solution |
| sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P2256 | component of supplement stock solution |
| L-glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | component of supplement stock solution |
| L-glutathione, reduced | Sigma Aldrich | G4251 | component of supplement stock solution |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | component of supplement stock solution |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | component of Ringer's solution |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | component of Ringer's solution |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma Aldrich | C3881 | component of Ringer's solution |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | component of Ringer's solution |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma Aldrich | M0250 | component of Ringer's solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | component of Ringer's solution |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 6 N HCl | Fisher Scientific | 02-003-063 | component of Na+-free Ringer's solution |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5655 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 50 mL conical centrifuge tube | Denville Scientific | C1062-P | container for Ringer's solution |
| Vannas scissors – 8 cm, angled 5 mm blades | World Precision Instruments | 501790 | micro-scissors for eyecup dissection |
| Swiss tweezers – #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips | World Precision Instruments | 504510 | fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation |
| single edge razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | for eyecup dissection and trimming filter paper |
| EMD Millipore filter forceps | Fisher Scientific | XX6200006P | flat forceps for handling wet filter paper |
| C12 558/568 BODIPY | Fisher Scientific | D3835 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 15 min at room temperature |
| propidium iodide (PI) | Fisher Scientific | P3566 | stains dead cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) | Fisher Scientific | T668 | stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature |
| tissue perfusion chamber | Cell MicroControls | BT-1-18/BT-1-18BV [-SY] | imaging chamber for injection or perfusion |
| 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG) | Fisher Scientific | N13195 | fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia |
| Olympus laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution |
| Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) | Sigma Aldrich | C2759 | experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 µM |
| miniature aspirator positioner | Cell MicroControls | FL-1 | for perfusion |
| perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder | Warner Instruments | various | for perfusion |
References
- Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Ma, E., et al. Loss of Pde6 reduces cell body Ca2+ transients within photoreceptors. Cell Death Dis. 4 (9), e797 (2013).
- Niethammer, P., Grabher, C., Look, A., Mitchison, T. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
- Andrews, N., et al. Visualising apoptosis in live zebrafish using fluorescence lifetime imaging with optical projection tomography to map FRET biosensor activity in space and time. J. Biophotonics. 9 (4), 414-424 (2016).
- Kioka, H., et al. Evaluation of intramitochondrial ATP levels identifies G0/G1 switch gene 2 as a positive regulator of oxidative phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (1), 273-278 (2014).
- Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-Time Visualizationof Neuronal Activity during Perception. Curr. Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
- Stewart, A., Braubach, O., Spitsbergen, J., Gerlai, R., Kalueff, A. Zebrafish models for translational neuroscience research: from tank to bedside. Trends Neurosci. 37 (5), 264-278 (2014).
- Zou, S. -. Q., Yin, W., Zhang, M. -. J., Hu, C. -. R., Huang, Y. -. B., Hu, B. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J. Vis. Exp. (36), e1742 (2010).
- Neuhauss, S. Behavioral genetic approaches to visual system development and function in zebrafish. J. Neurobiol. 54 (1), 148-160 (2002).
- Stearns, G., Evangelista, M., Fadool, J., Brockerhoff, S. A Mutation in the Cone-Specific pde6 Gene Causes Rapid Cone Photoreceptor Degeneration in Zebrafish. J. Neurosci. 27 (50), 13866-13874 (2007).
- Gross, J., Perkins, B. Zebrafish mutants as models for congenital ocular disorders in humans. Mol. Reprod. Dev. 75 (3), 547-555 (2007).
- Lewis, A., Williams, P., Lawrence, O., Wong, R., Brockerhoff, S. Wild-Type Cone Photoreceptors Persist Despite Neighboring Mutant Cone Degeneration. J. Neurosci. 30 (1), 382-389 (2010).
- Wang, T. -. M., Holzhausen, L., Kramer, R. Imaging an optogenetic pH sensor reveals that protons mediate lateral inhibition in the retina. Nat. Neurosci. 17 (2), 262-268 (2014).
- Van Hook, M., Thoreson, W. Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation. J. Vis. Exp. (76), e50007 (2013).
- Connaughton, V. Zebrafish retinal slice preparation. Meth. Cell Sci. 25 (1/2), 49-58 (2003).
- Kennedy, B., et al. Identification of a zebrafish cone photoreceptor-specific promoter and genetic rescue of achromatopsia in the nof mutant. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (2), 522-529 (2007).
- George, A., et al. Synaptojanin 1 is required for endolysosomal trafficking of synaptic proteins in cone photoreceptor inner segments. PLoS ONE. 9 (1), e84394 (2014).
- Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
- Giarmarco, M., Lindsay, K., Du, J., Cleghorn, W., Brockerhoff, S., Hurley, J. Imaging Real-time Glucose Uptake Reveals Distinct Transport Among Cell Types. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. , (2015).
- Kanow, M., et al. Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye. eLife. 6, (2017).
- Giarmarco, M., Cleghorn, W., Sloat, S., Hurley, J., Brockerhoff, S. Mitochondria Maintain Distinct Ca2+ Pools in Cone Photoreceptors. J. Neurosci. 37 (8), 2061-2072 (2017).
- Uckermann, O., et al. Selective staining by vital dyes of Müller glial cells in retinal wholemounts. Glia. 45 (1), 59-66 (2003).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current protocols in cytometry. , (2012).
- Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (99), (2015).
