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Bio-ingénierie

Área análisis sonda Nanolitografía facilitado por alineación automática y su aplicación a la fabricación de sustrato para estudios del cultivo celular

Published: June 12, 2018
doi:
10.3791/56967
, , , , , ,
1Manchester Institute of Biotechnology & School of Chemistry,University of Manchester, 2School of Engineering,University of Liverpool, 3School of Electrical and Electronic Engineering,University of Manchester, 4School of Science and Technology,Nottingham Trent University

Summary

Aquí presentamos un protocolo para área amplia exploración sonda Nanolitografía habilitado por el alineamiento iterativo de arreglos de discos de punta de prueba, así como la utilización de patrones litográficos para estudios de interacción de la superficie de la célula.

Abstract

Microscopía de sonda ha permitido la creación de una variedad de métodos para la fabricación de arriba hacia abajo (‘aditivo’) constructiva características de escala nanométrica. Un inconveniente importante de la exploración de sondeo de litografía ha sido históricamente, el intrínsecamente bajo rendimiento de los sistemas de la sonda solo. Esto se ha abordado mediante el uso de arreglos de discos de múltiples sondas para Nanolitografía mayor rendimiento. Para llevar a cabo tal paralelo Nanolitografía, la alineación exacta de matrices de la sonda con la superficie del sustrato es vital, para que todos los sondeos hacen contacto con la superficie al mismo tiempo cuando comienza a modelar litográfico. Este protocolo describe la utilización de la litografía de pluma de polímero para producir características de escala nanométrica sobre áreas centímetro de tamaño, facilitadas por el uso de un algoritmo para la alineación rápida, exacta y automática de matrices de la sonda. Aquí, Nanolitografía de tioles sobre sustratos de oro muestra la generación de funciones con alta uniformidad. Estos patrones luego son funcionalizados con fibronectina para uso en el contexto de los estudios de morfología celular dirigido de superficie.

Introduction

Avances en nanotecnología son dependiente en el desarrollo de técnicas capaces de manera eficiente y confiable fabricación características a nanoescala en superficies. 1 , 2 sin embargo, generando tal cuenta sobre grandes áreas (varios cm2) confiable y a un costo relativamente bajo es un esfuerzo no trivial. Mayoría de las técnicas existente, derivada de la industria de semiconductores, se basan en ablativo Fotolitografía para fabricar materiales ‘duros’. Más recientemente, técnicas litográficas derivadas de microscopía de sonda (local SPM) han surgido como un método conveniente y versátil para la creación rápida de prototipos de diseños de la nanoescala. 3 técnicas basadas en el SPM son convenientemente y rápidamente ‘ escribir ‘ ningún patrón definido por el usuario. El más bien conocido de éstos es Nanolitografía dip-pen (DPN), por Mirkin et al.,4 donde se utiliza una sonda de exploración que una ‘pluma’ para transferir una ‘tinta’ molecular a la superficie produciendo características de manera análoga a la escritura. Bajo condiciones ambientales, como una punta de prueba se analiza a través de una superficie las moléculas de ‘tinta’ se transfieren a la superficie a través de un menisco de agua que se forma entre la sonda y la superficie (figura 1). DPN por lo tanto permite la deposición nanolithographic de una amplia gama de materiales, incluyendo materiales “blandos” tales como polímeros y biomoléculas. 5 técnicas relacionadas usando puntas de prueba diseñados con canales para la entrega de fluido, diversamente conocido como ‘nanopipettes’ y ‘nano-plumas’, también se han divulgado. 6 , 7 , 8

El principal obstáculo para la aplicación de SPM-derivado de la litografía es el rendimiento, ya que requiere un tiempo excesivamente largo para áreas de escala centímetro patrón con una sola sonda. Primeros esfuerzos para abordar este tema se centran en la paralelización de DPN basado en voladizo, con ‘one-dimensional’ y ‘bidimensional’ matrices de sonda (2D) se informó de la litografía de áreas centímetro de tamaño. 5 , 9 sin embargo, estos arreglos de discos de voladizo se producen a través de métodos de fabricación de varias fases relativamente complejo y relativamente frágiles. La invención de la litografía de la pluma de polímero (PPL) abordó este problema mediante la sustitución de los voladizos SPM estándar con un array 2D de sondas de elastómero suave siloxano a un portaobjetos de vidrio. 10 esta configuración simple sonda disminuye significativamente el costo y la complejidad de patrones grandes zonas, apertura de nanolitografía a una amplia gama de aplicaciones. Esta arquitectura sin voladizo también se ha ampliado a punta de disco duro litografía suave primavera,11 que proporciona un híbrido suave forro elastomérico con puntas de silicona dura dando resolución mejorada en comparación con los patrones producidos con suave puntas de elastómero.

Un factor crucial en la ejecución de estas tecnologías de array 2D es que la matriz de la sonda debe ser exactamente paralela al superficie substrato para que cuando se utiliza la litografía, las sondas entran en contacto con la superficie simultáneamente. Incluso un pequeño desalineamiento puede provocar una gran diferencia en tamaño de la función de un lado de la matriz a otra, algunas sondas entrará en contacto con la superficie anterior durante el descenso de la matriz, mientras que otros entrará en contacto más adelante o no. 12 alineación exacta es especialmente importante con PPL debido a la deformabilidad de las sondas de elastómero suave, donde se comprimirá las sondas de contacto con la superficie anterior, dejando una huella más grande en la superficie.

El trabajo temprano en PPL empleados inspección puramente visual para guiar el proceso de alineación, mediante una cámara montada por encima de la matriz para observar la deformación de las sondas piramidales como fueron traídos en contacto con la superficie. 10 alineación juzgó a la observación de qué lado de las sondas entraron en contacto con la superficie en primer lugar, y luego ajustando el ángulo y repetir de forma iterativa hasta que la diferencia en contacto a cada lado de la punta de prueba fue indistinguibles para el ojo. Como este procedimiento de alineación se basa en la inspección visual subjetiva por parte del operador, es baja.

Posteriormente, se ha desarrollado un enfoque más objetivo, que consiste en un sensor de fuerza montado debajo del sustrato para medir la fuerza aplicada al contacto de las sondas en la superficie. 12 alineación así se logró mediante el ajuste de los ángulos de inclinación para maximizar la fuerza ejercida, que indicaron que las sondas estaban simultáneamente en contacto. Este método demostró que la alineación dentro de 0,004 ° el paralelo superficial era posible. Este ‘nivelación de retroalimentación de fuerza’ ahora se ha implementado en sistemas totalmente automatizados en dos informes independientes. 13 , 14 utilizar una tríada de sensores montados debajo del sustrato o sobre la matriz tanto medir la cantidad de fuerza ejercida al contacto entre la superficie y arreglos de discos de punta de prueba. Estos sistemas dan alta precisión, divulgación desalineamientos del ≤0.001 ° sobre una escala de 1 cm longitud,14 o ≤ 0,0003 ° sobre 1,4 cm.13 disponen de estos sistemas de alineación automática importantes ahorros en tiempo de operador y el tiempo total para completar el proceso de litografía.

Una aplicación importante de la fabricación superficial de alto rendimiento habilitado por esta tecnología es la generación de sustratos de cultivo celular. Ahora está bien establecido que fenotipo de la célula puede manipularse mediante el control de la interacción inicial entre las células y características superficiales, y que esto puede ser mejorado en la nanoescala. 15 específicamente, métodos de litografía de exploración sonda han demostrado ser un método fácil para producir una variedad de superficies nanofabricated para tales experimentos de cultivo celular. 16 por ejemplo, las superficies que presentan patrones de nanoescala de monocapas auto ensambladas y matriz extracelular proteínas con plantilla por PPL y DPN se han utilizado para estudiar el potencial de materiales nano-modificado en material inducido la diferenciación de células madre. 17

Este protocolo describe la utilización de un sistema de microscopio (AFM) de fuerza atómica modificado que permite gran superficie PPL. Detallamos la detección de la fuerza utilizando múltiples sensores de fuerza como los medios de determinar la superficie de la sonda de contacto, junto con un algoritmo que automatiza el proceso de alineamiento iterativo. Posterior funcionalización de estos patrones con la fibronectina de la proteína de matriz extracelular y la cultura de células madre mesenquimales humanas (hMSC) se describen como una manifestación de PPL fabricado superficies aplicadas para el cultivo celular.

Protocol

1. fabricación de la matriz de la pluma PPL Para preparar la mezcla de copolímero de polidimetilsiloxano (PDMS): Añadir 10 μl de platino (0) – 1, 3 – Divinilo-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane solución compleja y 172 μl de 1,3,5,7-tetrametil-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane para 250 g de (7-8% w/w vinylmethylsiloxane)-dimethylsiloxane copolímero. Mezclar estos componentes completamente en una mezcladora rotatoria durante 7 días para asegurar una mezcla homogénea.PRECAUCIÓN: Platino (0) – 1, 3 – Divinilo-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane es tóxico. Por favor lea MSDS antes de trabajar con esta solución. Equipo de seguridad debe ser usado al manejar el producto químico. Añadir 0,5 g de (25-35% w/w methylhydrosiloxane)-dimethylsiloxane copolímero a una porción de 1,7 g de mezcla de paso 1.1.1 en el pesaje de un barco y mezclar bien con una espátula. Desgasificar la mezcla por transferir a un desecador de vacío y exponer la mezcla a baja presión (200 mTorr, 0,3 mBar) por 20 min hasta que se hayan disipado todas las burbujas de gas. Lugar un portaobjetos de vidrio de 13 x 13 mm en un frasco plástico con tope de tornillo 20 mL 2-propanol, luego coloque el frasco en un baño ultrasónico durante 10 min eliminar cualquier basura grande. Lavar los portaobjetos sumergiendo los portaobjetos en fresco 2-propanol (100 mL) y secar bajo una corriente de gas nitrógeno. Poner un maestro de silicio18 en un plato de petri de 4 cm de diámetro y añadir suficiente desgasificada PDMS prepolímero mezcla (del paso 1.1) hasta totalmente cubierto. Por lo general, 100 μl se requiere para un master de 20 x 20 mm. Lugar el maestro con la mezcla del prepolímero en un desecador de vacío. Desgasificar el polímero para un más 5 minutos eliminar las burbujas de gas formadas durante la transferencia de la mezcla. El tratamiento de plasma de2 O de las diapositivas de cristal (paso 1.4 abajo) debe ser realizado mientras que la desgasificación se lleva a cabo. Tratar los cuadros de vidrio con O2 de plasma (600 mTorr) a máxima potencia de RF de 1 min para eliminar cualquier contaminación orgánica y para crear una capa uniforme de óxido sobre el vidrio para la adherencia del elastómero. 19 uso el plasma tratado diapositivas inmediatamente en el siguiente paso. Coloque con cuidado el portaobjetos de cristal cuadrada (de paso 1.4) sobre el prepolímero en el maestro (en el paso 1.3) con el limpiado de plasma hacia abajo. Presione suavemente el portaobjetos de cristal en el maestro de silicio para eliminar cualquier aire atrapado y para que una película uniforme de PDMS se intercala entre el maestro y la diapositiva. Lugar la matriz PDMS hojaldrada arriba paso en una placa Petri con el silicio principal en la parte inferior (es decir, con la parte posterior de la diapositiva de cristal hacia arriba) y colocar el plato en el horno a 70−80 c h 24−48 térmicamente curar el PDMS. Sacar la matriz curada del horno y dejar enfriar durante 15 minutos, luego con una cuchilla de afeitar con cuidado quite cualquier exceso PDMS de la parte posterior y lados del vidrio slide y una corriente de nitrógeno seco para soplar lejos cualquier residuo suelto de PDMS.Nota: tenga cuidado no de rayar el maestro de silicio con la hoja de afeitar, ya que podría dañar la capa antiadherente. Cuña de una hoja de afeitar en la esquina de la matriz a una profundidad de 1 mm y con cuidado apalanque la matriz aparte del maestro. Realizar esta acción en una sola acción continua de elevación; No permita que los arreglos de discos caer sobre el maestro. Corte con cuidado y raspe 0,5 mm de los PDMS en los bordes de la matriz con una cuchilla de afeitar. Utilizar una corriente de nitrógeno seco para soplar cualquier residuo suelto de PDMS.Nota: Puede ser más fácil de realizar este paso corte bajo estereoscopio o una lupa. Tenga cuidado de no rasguñar el maestro de silicio con la hoja de afeitar, ya que podría dañar la capa antiadherente. 2. preparación y montaje de sustrato de arsenal Generar una superficie hidrofílica en la matriz de sonda por tratamiento de plasma O2 : Coloque el conjunto de pluma PPL en caja Petri en cámara de plasma después de vacío a 600 mTorr. Encender el generador de plasma (valor máximo) durante 30 s. Libere el vacío, retire la matriz y compruebe su hidrofilicidad caer 20 μl de agua desionizada en la matriz y observando si hay incluso separarse del agua por toda la superficie. Si esto no ocurre, someter el conjunto a una segunda ronda de tratamiento del plasma. Luego, seca la matriz con una corriente de gas nitrógeno seco. Usando cinta de carbón de doble cara, coloque la matriz en el centro del porta sondas. Monte el soporte de la sonda sobre el soporte cinemático de AFM (figura 2). Para cargar la matriz PPL con ácido 16-mercaptohexadecanoic (MHA) (entintado): Preparar 1 m m 16-mercaptohexadecanoic ácido (MHA) solución disolviendo 8,6 mg en 30 mL de etanol en un tubo y colocarlo en un baño ultrasónico durante 10 minutos disolver totalmente el compuesto.PRECAUCIÓN: 16-mercaptohexadecanoic ácido es tóxico. Por favor lea MSDS antes de trabajar con esta solución. Equipo de seguridad debe ser usado al manejar el producto químico. Usando una micropipeta, depositar la gota de 20 μl de la solución MHA en la matriz. Evite el contacto de las puntas de pipetas con arreglos de discos. Permita que extendido por toda la matriz, a continuación, permitir que el etanol se evapore bajo condiciones ambientales.Nota: La matriz PPL alternativamente puede firmada después de la alineación. 10 Una vez que ha secado la solución MHA, Monte el soporte de la sonda con la matriz PPL en la AFM. 3. preparación de sustratos de oro para PPL. Sustratos de oro pueden adquirir, o hechos internos por térmica o electrón la deposición de la viga y están construidos con una capa de adherencia de titanio de nm 2 seguido de 20 nm de oro sobre una oblea de vidrio o silicio. 18 En caso necesario, limpie los sustratos tratamiento plasma de oxígeno utilizando los parámetros descritos en el paso 1.4. Colocar el sustrato de oro en medio de la etapa de muestra AFM y asegúrelo con cinta adhesiva alrededor de los bordes del sustrato (figura 2). Ajustar la etapa a la altura correcta como se indica en las instrucciones del fabricante utilizando la z-controlador de ejes. 4. automático alineamiento de matriz de pluma Abrir y ejecutar el controlador de la etapa el programa de instalación (SetupNSF.exe) en el equipo para restablecer (‘cero’) todos los ejes y ángulos a una pre-calibrada de punto cero, entonces utilice la etapa x/y-consola controlador de eje para mover el sustrato a la alineación deseada / Ubicación de la impresión. Para obtener resultados óptimos, el sustrato debe ser colocado cerca del centro de la etapa, entre sensores de fuerza de la etapa.Nota: en algunos modelos de computadora, el x/y-señal de eje controlador USB puede interferir con eso de la z-controlador de ejes. Si esto ocurre, desconecte el x/y-ejes controlador USB cable después de este paso. Entonces debe ser reconectado después del procedimiento de alineación (paso 4.7). Interruptor de la palanca de liberación de la etapa para lanzar la etapa de la muestra y la tríada de sensores de fuerza como se indica en las instrucciones del fabricante de la AFM. Permitir que los sensores de fuerza que equilibre durante al menos 15 minutos. Para obtener resultados óptimos, deje que 30-50 min. Aumentar la altura del eje z para poner la matriz en proximidad cercana con el sustrato visualmente observando la matriz de la sonda y la superficie.Nota: Cuanto más cerca la matriz es a la superficie, las menos iteraciones se requieren para el proceso de alineación, ahorrando tiempo. Abrir/ejecutar el programa de alineación automática (Auto alineación v16.exe) y entrar en parámetros de alineación correspondiente en el programa. Introduzca el valor del parámetro deseado ‘paso de ángulo’, normalmente 0,15 °. Este parámetro es el ángulo de desvío del ángulo ‘óptimo’ para cada eje que está determinado por el programa. Establezca este parámetro entre 0,1 y 0,2 °, como ángulos inferiores a este rango no resultan en una diferencia de fuerza claramente perceptible al enfoque de las sondas a la superficie.Nota: Software acepta valores en millidegrees (es decir,, 1 x 10-3 °). Por ejemplo, 0,15 °, los usuarios deben ingresar ‘150.’ Entrar en el paso grueso deseado ‘ el valor del parámetro, normalmente de 0,6 μm. Este parámetro es el tamaño de paso de eje utilizado por el escenario cuando se acerca a las sondas en la alineación inicial de áspera. Establezca este parámetro entre 0.2 y 1 μm. más grande paso disminución de tamaños el tiempo necesario para el proceso de alineación, pero reducir la exactitud de la alineación y aumentar el desgaste de las puntas de prueba.Nota: El Software acepta valores de gruesos medidas en micrómetros. Por ejemplo, de 0,6 μm los usuarios deben ingresar ‘0.6’. Introduzca el valor deseado del parámetro ‘Paso fino’, típicamente 0,2 μm. Este parámetro es el tamaño de paso del eje utilizado para el ajuste fino de la alineación óptima. Para la mayoría de las aplicaciones, establezca este parámetro entre 0,1 y 0,4 μm. valor paso más grandes serán disminuir la cantidad de tiempo necesario para el proceso de alineación pero reducir la calidad de la alineación.Nota: El Software acepta valores de pasos finos en micrómetros. Por ejemplo, de 0,2 μm, los usuarios deben ingresar ‘0.2.’ Configurar la ‘ruta del archivo Excel’ y adjuntar una copia sin modificar del archivo de plantilla de hoja de cálculo proporcionada mediante el icono ‘carpeta’, navegando por la ubicación del archivo y pulsando ‘OK’. Este archivo contiene los datos crudos y calculados que se utilizan para determinar los ángulos de inclinación de la etapa óptima de la etapa. Abrir/ejecutar el software de control de la AFM. Desplácese hasta el componente de espectroscopia de este programa haciendo clic en el botón ‘espectroscopia’ (según las instrucciones del fabricante) y establecer el eje z principal análisis AFM a oscilar de 10 μm más de 100 ms, con un tiempo de pausa de 250 ms, luego para retraer 10 μm durante 100 ms con un tiempo de pausa de 250 ms (figura 3). Como la cabeza AFM es oscilante, haga clic en el botón ‘start’ del software de alineación para comenzar el proceso de alineación automática. Cuando se ejecuta el programa, el software es escribir y leer datos en el archivo que se describe en el paso 4.4.4.Nota: La alineación toma entre 30 min y 3 h dependiendo de la posición de la etapa inicial de paso 4.3 y configuración de software que fueron introducidos en el paso 4.4.PRECAUCIÓN: Las consolas de control de etapa son todavía activo durante el proceso de alineación – no las utilice durante el proceso de alineación que interferirá con la alineación. Cuando termina la alineación, se encenderá la luz verde caja ‘Alineación completa’ en el software de la alineación (de paso 4.4). Cuando esto ocurre, haga clic en el botón ‘STOP’ en la interfaz de usuario para finalizar el proceso de alineación. Inspeccionar los gráficos en el archivo de plantilla de hoja de cálculo de una correlación entre puntos de datos y la línea de ajuste que se genera por el software. Ver resultados representativos ejemplos de una buena correlación con valores típicos de2 R de > 0,99. Si la alineación no funciona, reemplace el conjunto de sonda con una matriz recién preparada (paso 2) y repita la alineación (paso 4.4). La etapa se mueven hacia arriba en el z-eje usando la consola de control de fase para ese eje. La etapa se debe mover en incrementos de nm 500 hasta que el contacto puede ser observado desde la cámara superior de la AFM. Contacto entre la matriz y el substrato puede observarse como un ‘punto blanco’ de alto contraste en el vértice de las pirámides de sonda individual. En este punto, haga clic en el botón ‘stop’ en el software de control AFM para detener el programa de la espectroscopia del paso 4.5. Esto retraerá el arreglo de discos de 10 μm, por lo tanto, dejando a 10 μm de extensión posible del eje z. Compruebe la imagen de la cámara de la vista superior de la AFM para asegurarse de que las sondas no están en contacto con el sustrato. 5. litografía de pluma polímero (PPL) Desplácese hasta el componente de litografía del software de control pulsando el botón ‘litografia’ en el software de control. Elegir el z-modulación de funcionamiento e importar un raster (mapa de bits) o vector de imagen que se utilizará como patrón de la litografía. Para generar las características que se muestra en los resultados representativos, utilice un mapa de bits que consta de 20 x 20 píxeles negros (ver material suplementario), correspondiente a la litografía de una cuadrícula de 20 x 20 puntos por sonda en la matriz PPL. Introduzca los parámetros de la litografía en la ventana ‘Importar gráfico de píxeles’ del software de controlador AFM. Configurar el ‘tamaño’ del patrón que se generen, por ejemplo, 40 μm en longitud y anchura. Estos parámetros indican la anchura y la longitud sobre la cual se escalarán la imagen del mapa de bits. Para generar características que se indican en los resultados representativos, utilice un ancho y largo de 40 μm en ambas dimensiones. Establecer el origen del patrón que se generen en 25 μm en eje x e y . Estos parámetros determinan el centro de la imagen en relación con el centro de la AFM x/y-ejes. Establecer estos parámetros para evitar que la región de la superficie donde las sondas estaban en contacto durante el proceso de alineación. Configurar la impresión ‘Parámetros’. Estos valores determinan cómo las sondas deben ser extendido (es decir, traído en contacto con la superficie) en respuesta a cada píxel de la imagen de mapa de bits. Seleccione en el menú desplegable ‘Modulación Abs Z Pos’ y ‘Simplificar a’ dos capas. Este modo indica a la AFM para extender las puntas de prueba por una absoluta distancia determinado por solamente dos resultados, o bien ‘Negro (0)’ o ‘Blanco (1)’ campos. Configurar los valores en los campos ‘Blanco (1)’ y ‘Negro (0)’ en 5 y -5 μm, respectivamente. Estos valores determinan la distancia de las puntas de prueba se deben moverse en respuesta a un píxel blanco o negro en la imagen de mapa de bits y se suelen establecer entre 3 y 5 μm para el ‘Negro’ (es decir, extender las sondas hacia abajo por esa distancia en relación con el punto cero del eje) y -3-5 μm para el ‘Blanco’ (es decir, retirar las puntas hacia arriba por 3 a 5 μm, en relación con el punto cero).Nota: Estas distancias representativas asumen que una extensión de 5 μm los resultados en los sondeos entre en contacto con la superficie y por lo tanto, la generación de una función, mientras que un retiro de 5 μm levanta las puntas de prueba de la superficie de no contacto. Z-extensión afecta tamaño de la función de determinar el grado de contacto de la sonda con el resultado de extensiones de superficie, mayor en las sondas se presiona más a la superficie, lo que resulta en características más grandes. 10 Haga clic en el botón ‘Aceptar’ para aplicar estos ajustes y cerrar la ventana. Introduzca el tiempo de’ pausa’ en la ventana de litografía del software de control AFM, típicamente 1 s. Esta configuración determina la longitud de las sondas permanecen en la posición extendida de ‘Negro’, que normalmente está entre 0.1 y 10 s de tiempo.Nota: Tiempo de pausa resultado en tamaños más grandes de la característica debido a la mayor cantidad de MHA transportado a la superficie de oro. Pueden encontrar más detalles sobre cómo controlar el tamaño de características generadas en otros informes. 20 Preparar la caja de control atmosférico. Baje la cámara de aislamiento atmosférico sobre la AFM y abrir/ejecutar el software de control atmosférico proporcionado por el fabricante (MHG_control.exe). Configure el software de control atmosférico para mantener una humedad relativa de 45%, una temperatura de 25 ° C y un atmósfera de intercambio ‘Caudal’ de 500 mL introduciendo estos valores en el software. Haga clic en ‘Usar’ para implementar la configuración. El módulo de control atmosférico comenzará a bombear aire humidificado en la cámara.Nota: Niveles de humedad superiores resultan en tamaños más grandes de la característica debido a la formación de un menisco de agua más grande generada entre superficie y arreglos de discos de lápiz. 21 este valor se establece por lo general entre 40 y 60%. La tasa de flujo se encuentra típicamente entre 300 y 500 mL. Mayores flujos permita que el nivel de humedad deseado se alcanza más rápidamente pero es menos precisos. Resultados representativos utilizar un caudal de 500 mL para la generación inicial de humedad y se reduce a 300 mL al llegar a la humedad deseada, para mantener un nivel estable y preciso en litografía. Una vez obtenido el nivel de humedad deseado, comenzar la secuencia litográfica pulsando el botón ‘Inicio’ en la interfaz del software. Sobre la terminación de la litografía, utilice la consola de control del eje z etapa mover el sustrato de la matriz de la etapa de los tramos de 500 μm. Luego extraiga la cámara de aislamiento atmosférico de su montura. Interruptor de la palanca de liberación del escenario para cerrar la etapa de muestra y desactivar los sensores de fuerza, como se indica en las instrucciones del fabricante de la AFM, luego retirar el sustrato de la etapa. 6. visualización del patrón Patrones pueden visualizarse utilizando uno de los métodos siguientes, lateral fuerza grabado microscopia o química sonda de exploración. Escanear la superficie modelada en AFM con modo de fuerza lateral con voladizo de modo de contacto para examinar las características de manera no destructiva.Nota: Microscopía de fuerza Lateral puede utilizarse como un método no destructivo de visualizar las características producidas por la litografía de la pluma del polímero; sin embargo, usando este método, solamente un área relativamente pequeña puede ser visualizado (típicamente 100 x 100 μm). Puesto que la MHA depositada puede actuar como una resistencia de etch, aguafuerte química puede utilizarse para extraer el oro de las áreas no-patrón. Las áreas que luego pueden ser visualizadas por microscopia óptica, lo que significa que un área amplia puede verse a la vez. 18Nota: Los sustratos que están grabados de esta forma no pueden utilizarse entonces para los experimentos de cultivo celular subsecuente que se describe a continuación. Por separado, preparar soluciones acuosas de tiourea de 40 mM, nitrato de hierro (III) de 27 mM y 100 mM de ácido clorhídrico. Para preparar el grabador, mezclar 5 mL de cada una de estas tres soluciones. Recién la mezcla antes de cada uso. 22PRECAUCIÓN: tiourea, nitrato de hierro (III) y el ácido clorhídrico son tóxicos. Por favor lea MSDS antes de trabajar con esta solución. Equipo de seguridad debe ser usado al manejar el producto químico. Transferir el sustrato estampado en una placa de Petri y pipetas suficiente solución de grabador en el plato para cubrir la superficie del sustrato (típicamente 10 mL). Mantener el sustrato sumergido durante 4-5 minutos grabar 15 nm de oro (a un ritmo aproximado de 3 nm/min). Cuando se termina el grabado, retire el sustrato y enjuagar cuidadosamente con agua y seca con corriente de nitrógeno.Nota: La terminación del proceso de la aguafuerte se determina por el grosor de la superficie de oro obtenida (paso 3.1) asociado con la tasa de ataque especificada (paso 6.2.2). Inspeccionar las características de oro grabadas bajo microscopía óptica de campo claro. Las características de oro restantes que permanecen deben aparecer correspondientes al patrón que fue impreso (de paso 5.2). Si aparece homogénea toda la superficie, esto indica que sigue siendo una cantidad significativa de oro y el paso de la aguafuerte (siguiente paso 6.2.2) se debe repetir durante 1-2 minutos. 7. patrón de funcionalización con fibronectina Sumerja los sustratos modelados en una solución de solución de hexa(ethylene glycol) de 1 mM (11-mercaptoundecyl) en etanol de 1 h. lavado el sustrato tres veces con etanol y secar bajo una corriente de nitrógeno. Este paso apacigua las áreas oro liso.PRECAUCIÓN: hexa(ethylene glycol) (11-mercaptoundecyl) es tóxico. Por favor lea MSDS antes de trabajar con esta solución. Equipo de seguridad debe ser usado al manejar el producto químico. Sumerja los substratos en una solución acuosa de Co (NO3)2 por 5 min de 10 mM. A continuación, quite los sustratos de la solución, lave tres veces con agua ultrapura y seca bajo una corriente de nitrógeno seco.PRECAUCIÓN: Co (NO3)2 es tóxico. Por favor lea MSDS antes de trabajar con esta solución. Equipo de seguridad debe ser usado al manejar el producto químico. Sumergir el sustrato en una solución de 50 μg/mL de fibronectina en tampón fosfato salino (PBS), incubar a 4 ° C por 16 h. lavado el sustrato tres veces con PBS y secar el sustrato bajo corriente de nitrógeno seco.Nota: Fibronectina está limitada a áreas MHA funcionalizados mediante quelación de co por los grupos de ácido carboxílico terminal en MHA. Fibronectina une entonces al co a través de su dominio de unión a colágeno. 23 Si lo desea, visualizar la fibronectina superficie-limita por marcaje con anticuerpos fluorescentes: Aplique una solución de 2 mL de 1: 100 no conjugada anti fibronectina primaria anticuerpos en 5% (p/v) de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS a la superficie e incubar a 4 ° C por 16 h. aspirar el sobrenadante y lavar tres veces con PBS. Sumergir el sustrato en una solución de 2 mL de anticuerpo secundario anti-conejo conjugado fluorescente (en dilución especificada del fabricante, 2 gotas/mL) en 5% (p/v) de BSA en PBS, cubierta en papel de aluminio e incubar a temperatura ambiente durante 1 h. aspirado del sobrenadante y lavar tres veces con PBS. Grabar las imágenes de microscopía de epifluorescencia de las funciones mediante un microscopio de fluorescencia según las instrucciones del fabricante, con un filtro de excitación se establece en 594 nm. 8. cell culture en superficies nanofabricated Preparar una suspensión de hMSCs bien caracterizado que se encuentran entre los 4th y 6th paso. 24 Suspender un frasco confluente de células de enjuague una vez con 10 mL de PBS, disociar las células adheridas al agregar 5 mL de tripsina/EDTA en el matraz de cultivo de tejidos T75 e Incube el frasco en una cámara humidificada a 37 ° C suplementado con 5% CO2 para hasta 5 min hasta el 90% o las células f son independiente de la superficie. Posteriormente, añadir 6 mL fresco de medios de cultivo que contiene 10% de suero fetal de ternero (FCS) en el frasco y enjuague el matraz con los medios de comunicación ha añadido. Transferencia de suspensión de células en un tubo de centrífuga de 15 mL y centrifugar a 400 g a 25 ° C durante 5 minutos. Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 3 mL de medio de cultivo fresco. Contar la densidad de células usando un hemocitómetro25 y ajustar la densidad de la suspensión celular a 2 x 104 células/mL mediante la adición de un volumen adecuado de medio de cultivo. Semilla de las células en sustratos con una densidad de 104 células/cm2. Cortar el sustrato de 1 x 1 cm2 con escriba diamante y colocarlo en un pozo en placa de cultivo de tejido 12-bien. Pipetear 2 mL de la suspensión celular en medios de cultivo (desde el paso 8.1.4) en el pozo e incubar en cámara humidificada a 37 ° C suplementado con 5% CO2 durante 24 h. Después de crecimiento celular en los patrones, analizar el grado de adjunto de la celular y separarse por inmunofluorescencia: Los medios de comunicación Lave y sustratos una vez con PBS. Fijar las células con 2 mL de una solución de paraformaldehído al 4% en PBS (previamente calentado a 37 ° C) por 20 min en la campana y lavar tres veces con PBS.PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es tóxico. Por favor lea MSDS antes de trabajar con esta solución. Equipo de seguridad debe ser usado al manejar el producto químico. Permeabilizar las células con 2 mL de una solución de detergente de 0,5% (véase Tabla de materiales) en PBS durante 15 min, luego lavar tres veces con PBS. Sumergir el sustrato en 2 mL de una solución de anticuerpo primario de conejo no conjugada anti-fibronectina en dilución de 1: 100 con 5% (p/v) BSA en PBS incubar a 4 ° C por 16 h, y lavar tres veces con 0,1% (v/v) Tween 20 en PBS (SAFT). Posteriormente sumerge el sustrato en 2 mL de una solución de anticuerpo secundario fluorescente conjugado anti-conejo (diluido con un 5% (p/v) BSA en PBS en dilución especificada del fabricante, 2 gotas/mL), cubierta en papel de aluminio e incubar a temperatura ambiente durante 1 h, luego lavar tres veces con 0.1% SAFT. Para etiqueta de filamentos de actina, sumergir 2 mL de phalloidin fluorescente conjugado a la dilución de 1: 250 en PBS, cubierta en papel de aluminio e incubar a 4 ° C por 30 min y lavar tres veces con PBS. Simultáneamente núcleos celulares de la mancha y Monte el sustrato aplicando una gota de montaje medio con DAPI y cubrir con un cubreobjetos. Visualizar las células mediante un microscopio de fluorescencia según las instrucciones del fabricante, con filtros de excitación de 365 nm para núcleos (DAPI), 488 nm para la F-actina y 594 nm para la fibronectina.

Representative Results

Para comprobar si la alineación automática había sido un éxito, se analizaron las gráficas trazadas desde los datos de alineación (en la hoja de cálculo en el paso 4.8). Donde el proceso de alineación han tenido éxito las dos parcelas, correspondientes al ángulo por el cual la etapa de la muestra haya sido inclinada a lo largo de los ejes θ y φ, mostraron una serie de levantamiento y descendentes puntos de datos. En cada una de las parcelas, dos ajustes lineales de los puntos de datos demostraron una intersección bien definido “pico” que indica la máxima z-extensión y el correspondiente ángulo en el que la alineación fue alcanzado (Figura 4A y 4B). Este proceso es repetido cuatro veces (es decir, dos veces para cada eje) y graficados como un conjunto de cuatro coordenadas. Así, la intersección de cada par de coordenadas muestra los ángulos en general óptimos (figura 4). 13 en casos donde la alineación no fue exitosa, se puede observar que su correspondiente θ y φ ángulo parcelas no dan ajustes lineales de buena calidad, o no se cruzan (figura 5). Estos alineamientos son típicamente como resultado de los arreglos de discos se mal ajustado o montado en el porta sondas (pasos 1.7, 1.8 y 2.2). En estos casos, los arreglos de discos se descartaron un nuevo preparado y había montado (pasos 1 y 2) y repite el proceso de alineación (paso 4). Alineación exitosa y litografía con MHA de PPL, sustratos de oro estampados fueron luego reflejados usando microscopía de fuerza lateral para examinar si la deposición había producido. Se realizó también un examen de área más grande de las superficies impresas por microscopía óptica de los substratos después del grabado del oro no protegido por el tiol depositado (figura 6 y figura 7). Sin embargo, los patrones de grabado no pueden utilizarse para más funcionamiento y deben usarse únicamente para confirmar patrones en muestras representativas de un lote de sustratos superficie impresos. Si los patrones grabados muestran áreas en blanco correspondientes a jaulas individuales (figura 8), este resultado indica que la producción de arreglos de discos de sonda no se ha hecho con éxito, y que algunas sondas están dañada o falta. Esta inhomogeneidad de las sondas puede ser debido al uso de un viejo maestro donde la capa perfluorados ha desgastado (paso 1.3), dando por resultado algunas sondas rasgadas lejos cuando la matriz se separa del maestro. En estos casos, debe utilizarse un nuevo maestro. El resultado también puede deberse a la presencia de aire burbujas atrapado entre el vidrio del forro y el maestro (criterio 1.5), o si la matriz de la sonda no fue limpio separada del maestro después de curar (paso 1.8). Imágenes de microscopia fluorescente de las superficies de fibronectina funcionalizado hMSCs incubados fueron también recogieron (figura 9). En general, todos los sustratos fueron estables en el ambiente de cultivo en vitro y las células se adhirieron y adaptaron su morfología a los patrones impresos en caso de menor aislada 20 x 20 matriz de características. Figura 1. Representación esquemática de la litografía de la pluma de polímero con transporte molecular de la tinta a través de un menisco de agua en la punta. (A) vista lateral y vista (B) superior de la matriz de polímero pluma indican que cuando el matriz de sonda y el substrato superficial estén completamente alineados, todas las sondas entran en contacto con la superficie al mismo tiempo, dando por resultado la litografía paralelizada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2. Diagrama esquemático de la litografía de polímero pen set arriba (A) vista lateral ampliada de configuración experimental donde la matriz de sonda preparado es ATA para soporte de la sonda y montada en escáner AFM. El sustrato se coloca en el escenario, debajo de que se encuentran los tres sensores de fuerza. (B) representación de la instrumentación montada, mostrando la cabeza de exploración AFM en relación con la etapa de la muestra. Vista inferior (C) que muestra la ubicación del sensor de fuerza. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3. Representación esquemática que representa el programa de espectroscopia para el procedimiento de alineación. El escáner AFM se encuentra para mover las sondas hacia muestra a una distancia de 10 μm a 100 ms, en la posición de 250 ms, seguida de una contracción de 10 μm a 100 ms y luego destinados a 250 ms en la posición retraída. El movimiento se repite en todo el proceso de alineación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4. Gráficos que ilustran una alineación exitosa. Gráficos de posición en z contra los ángulos de inclinación (A) θ y φ (B) para una alineación exitosa, donde ● indica los valores reales medición y + indica el mejor ajuste con el método de mínimos cuadrados. (C) gráfico de φ contra θ había equipado ángulos con los cuatro puntos donde se alcanzó la máxima posición de z. El punto de intersección marcado es el ángulo de inclinación óptimo final en ambos ejes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5. Gráficos que ilustran una alineación. Gráficas de posición z contra los ángulos de inclinación (A) θ y φ (B) para una alineación fracasada, donde ● indica los valores reales medición y + indica el mejor ajuste con el método de mínimos cuadrados. (C) gráfico de φ contra θ había equipado ángulos con los cuatro puntos donde se alcanzó la máxima posición de z. No optima claro o punto de intersección se observan y por lo tanto los ángulos de alineación óptima no se resuelven. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6. Microscopía óptica ilustrativo e imágenes de microscopía de fuerza atómica de sustratos de oro que fueron estampados con MHA por las matrices PPL alineadas y entonces al. (A) y (B) son imágenes de microscopía óptica magnificada secuencialmente de los patrones de grabado; (C) es una imagen de la topografía AFM de una sola red de patrones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 7. Imágenes de microscopía óptica ilustrativos de sustratos de oro que fueron estampados con MHA por las matrices PPL alineadas y luego al. (A) y (B) son imágenes de microscopía óptica magnificada secuencialmente de patrones de grabado al agua fuerte y (C) es una imagen de aumento más bajada que muestra área homogéneos patrones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 8. Imagen de microscopía óptica ilustrativa de un substrato de oro que fue irregularmente estampado con MHA y luego al. Los patrones previstos (se muestra en la ilustración) estaban repitiendo rejillas de 20 líneas de puntos dispuestas en 20 líneas, con cada dos líneas producidas al aumentar el z-extensión de eje de 1 μm (desde 5-5 μm). Puede verse que en algunas zonas no se generan patrones, debido a las sondas que falta en esos lugares. En las zonas donde se producen sólo dos líneas de puntos, este resultado indica que una punta de prueba está presente pero no es de la misma altura que las puntas de prueba completamente funcional, tan único depósito ofrece cuando la matriz se extiende a todo z-distancia del eje. En esta imagen, el contraste ha sido alterado deliberadamente para permitir la observación de las zonas parcialmente impresas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 9. Imágenes de microscopía de epifluorescencia de hMSCs cultivadas en las matrices de la fibronectina con plantilla por PPL. (A) y (B) son imágenes de gran aumento que muestra las células individuales. (C) muestra un patrón de ejemplo de la matriz de fibronectina sin un adherente celular y (D) es una imagen de gran campo de las células cultivadas en un arreglo de rejilla (un esquema del patrón impreso también se muestra en la carátula). Las células se tiñen para mostrar fibronectina (rojo), F-actina (verde) y los núcleos (azul) de la célula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Este protocolo sirve para proporcionar a los usuarios una metodología conveniente realizar rápidamente nanolithographic patrones con alta uniformidad y tamaño de la función controlable sobre grandes áreas (cm2). Substratos teniendo estos nanopatrones área entonces pueden elaborarse más para una variedad de aplicaciones. Una aplicación importante de esta tecnología es en la generación de superficies nanofabricated para estudios de interacción de la superficie de la célula. Este informe muestra algunos ejemplos ilustrativos del cultivo celular en estos materiales, demostrando control de hMSC morfología por sustratos nanofabricated.

El componente clave de este protocolo es la automatización del procedimiento de alineación (paso 4) que permite la producción altamente uniforme y alto rendimiento de características sobre superficies, hasta resolución de la nanoescala, que permite la rotación rápida de los experimentos de cultivo celular. La litografía de la pluma de polímero realizada utilizando este algoritmo de alineamiento es capaz de generar características a nanoescala dentro de aproximadamente 30 minutos. La reproducibilidad y exactitud de la alineación automática y así la uniformidad de las características de modelado, es sin embargo críticamente dependiente en la calidad de los arreglos de discos de punta de prueba que produce (paso 1 y 2). Algún defecto en su elaboración que sondas embotadas, rotas o ausentes; tales como aire atrapado burbujas (criterio 1.5) o separación incorrecta de las sondas del maestro (paso 1.8) puede resultar en alineación imprecisa y litografía de mala calidad.

Este divulgado método comparte un límite en común con otros métodos de alineación que se basan en la retroalimentación de fuerza. La determinación exacta de cuando las sondas están en contacto con la superficie está limitada por la necesidad de tener en cuenta las vibraciones de fondo causadas por el ambiente y el movimiento de la etapa de la muestra. En general, los sensores tienen una sensibilidad a la fuerza en el régimen µN (2 µN en este caso), pero el algoritmo de alineamiento está diseñado para registrar sólo una fuerza de por lo menos 490 µN como contacto definitivo entre la sonda y la superficie, para evitar cualquier resul ‘falsos positivos’ Ting de ruido de fondo. 13 por lo tanto, este método tiende a producir grandes características (1-2 μm) ya que las sondas deben extendido a una gran distancia en z-eje (con una consecuente mayor fuerza) para registrar el contacto. Para compensar, características más pequeñas pueden generarse mediante la reducción de la z-eje distancia recorrida durante el paso de la litografía (p. ej., entrar en el ajuste ‘Negro’ en el paso 5.2.3.2 como 3 μm en lugar de 5 μm).

Sin embargo, incluso con esta limitación, el algoritmo de automatización es capaz de abordar un aspecto crítico en la aplicación del paralelo métodos de litografía sonda escaneo, alineación era previamente más exigentes e impreciso paso del tiempo en la aplicación de estas técnicas. Esta automatización ahora cambia el paso tarifa-limitador del proceso de fabricación de la alineación a la litografía de la escritura sí mismo. Si bien este protocolo demuestra la aplicación de este procedimiento de alineación a PPL, el marco podría aplicarse a un número de técnicas SPL como lípido-DPN26 y litografía matriz asistió27 futuro potencial catalítico sistemas de la sonda. 28

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores reconocen el apoyo financiero de una variedad de fuentes incluyendo el Reino Unido ingeniería y Consejo de investigación de ciencias físicas (concesión a refs. EP/K011685/1, K024485/EP/1) y una beca de posgrado para JH; la confianza de Leverhulme (RPG-2014-292); el fondo de apoyo estratégico institucional de la Wellcome Trust (105610/Z/14/Z); el British Council (216196834); y la Universidad de Manchester para una Universidad de Manchester Instituto de investigación (fondo de cebado de la bomba UMRI) y una beca de doctorado presidencial para asistencia técnica de SW por el Dr. Andreas Lieb (sistemas de Nanosurf AG) es también agradece.

Materials

Equipment
FlexAFM mounted on a motorised 5-axis (XYZΘΦ) translation and goniometer stage NanoSurf P40008
AFM control software NanoSurf C3000
Engraving pen Sigma-Aldrich Z225568
Plasma Cleaner Harrick plasma PDC-32G-2
PlasmaFlo Harrick plasma PDC-FMG-2
Economy Dry Oxygen Service Pump Harrick plasma PDC-OPE-2
Tube Rotator Stuart SB3
Vacuum Desiccator Thermo Fisher Scientific 5311-0250
Milli-Q Water Purification System Merck Millipore ZRXQ015WW
Modular Humidity Generator proUmid MHG32
Proline Plus Pipette 100-1000 µL Sartorius 728070
Silicon masters NIL Technology custom-made
Upright snapshot fluorescence microscope Olympus BX51
Microscope objectives Olympus 10x and 60x UPlan FLN ∞/-/FN 26.5
Upright bright field microscope Leica DM 2500M
Ultrasonicator Ultrawave Ltd. U95
Spreadsheet for recording and intepreting automated alignment results Microsoft Excel
Reagent
2-propanol Sigma-Aldrich 34863 FLAMMABLE
Microscope Sildes, Clear, Ground Thermo Fisher Scientific 451000
(7–8% vinylmethylsiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxy-terminated Gelest VDT-731
1,3,5,7-tetramethyl-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane Gelest SIT7900.0
Platinum(0)-1,3-divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane complex solution Sigma-Aldrich 479527 HARMFUL, TOXIC
(25–35% methylhydrosiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxane-terminated Gelest HMS-301
Weigh Boat 100 mL Scientific Laboratory Supplies BALI828
Pasteur pipette Appleton Woods KS230
Petri dish SARSTEDT 82.1473
Razor blade Thermo Fisher Scientific ST10-031T
Adhesive Carbon Tape Agar scientific AGG3939
16-Mercaptohexadecanoic acid Sigma-Aldrich 448303-1G HARMFUL, TOXIC
Ethanol Sigma-Aldrich 34852 FLAMMABLE
Gold coated microscope slide Sigma-Aldrich 643203 Once opened gold will remain reactive to thiols for at least 1 month
Thiourea Sigma-Aldrich T8656 HARMFUL, TOXIC
Iron(III) nitrate nonahydrate Sigma-Aldrich 529303 HARMFUL, TOXIC
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 84415 HARMFUL, TOXIC
(11-Mercaptoundecyl)hexa(ethylene glycol) Sigma-Aldrich 675105 HARMFUL, TOXIC
Fibronectin from human plasma Sigma-Aldrich F0895
Cobalt(II) nitrate hexahydrate Sigma-Aldrich 203106 HARMFUL, TOXIC
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium Lonza UK PT-3001
Human Mesenchymal Stem Cells Lonza UK PT-2501
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T4174
Heraeus Multifuge X1 Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004210
CELLSTAR Centrifuge Tubes Greiner Bio-One 188261
Paraformaldehyde Fisher Scientific P/0840/53 HARMFUL, TOXIC
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 "Detergent" in manuscript
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Rabbit anti-fibronectin antibody Abcam ab2413
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 Thermo Fisher Scientific R37117
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A3912
12-well plate Thermo Fisher Scientific 10253041
T75 tissue culture flask Thermo Fisher Scientific 10790113
cantilever BudgetSensor ContAl-G
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Citer Cet Article
Lee, I., Hosford, J., Wang, S., Hunt, J. A., Curran, J. M., Heath, W. P., Wong, L. S. Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies. J. Vis. Exp. (136), e56967, doi:10.3791/56967 (2018).
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