生体内で1 分子追跡ショウジョウバエ運動神経がシナプス前ターミナルで

1. mEos2 付けられた蛋白質を表現する遺伝子組換えショウジョウバエのデザイン MEos2 タンパク質とタグに蛋白質を選択します。画像処理の成功率を上げるには、膜貫通ドメインを持つタンパク質で選択神経膜14 (例えば、変異シンタキシン 1 a)、シナプス小胞またはオートファゴソーム26,27 (例えば、蛋白質Synaptobrevin-2)、または神経の膜蛋白質 (例えばMunc18 1) と密接な相互作用と細胞質蛋白質。 MEos2 タグ付きタンパク質 (図 1) をエンコードする遺伝子を構築します。蛋白質および mEos2 のための前方および逆のプライマーを設計します。注: mEos2 コーディング シーケンスは興味の蛋白質の C 末端に融合するように設計された pmEos2 N1 プラスミッドから増幅することができます。クローニングなど、酵母pFL44S を使用して体内組換えによって行うことが-attB-MCS-w +14,28のベクトル、ギブソンなど他のクローンの作成方法を使用できる代わりにアセンブリ プロトコル29。 病原と XbaI ベクトルを線形化し、共同ura3 mEos2 および興味の蛋白質を符号化する PCR のフラグメントと酵母細胞に変換します。トランスジェニック フライ ライン30を生成する構築とショウジョウバエの胚を注入します。 リアの標準酵母、糖蜜培地またはプラスチック バイアルに含まれているいくつか他の適切な代替のトランスジェニック フライ文化。確実に健康的なかなり大規模なシナプス研究31をバイアル、過密のハエや毎日産卵; の後新しい瓶にハエを反転これにより第 3 齢幼虫も供給し、彼らは媒体の徘徊開始時間によって適切なサイズに達する。室温 (25 ° C) でトランスジェニック フライを上げます。注: 大きなシナプス ボタン イメージの中に可視化蛋白質の大きい量を生成する傾向があります。 2. 第 3 齢幼虫の郭清 円柱状または凹形ポリジメチルシロキサン (PDMS) 基本引時間: 20 mm 径と引時間: 20 mm の高さの適切なシリコーン エラストマー キット (図 2 a) を使用して。硬化剤 10:1 の比率でシリコーンとシリコーン ・ エラストマーをミックスします。 5 分、dimsensions と金型に混合物が上記を注ぐのため徹底的に混合物をかき混ぜなさい。45 分間 100 ° C のオーブンで強化しましょう。PDMS のベースは、郭清を行う基盤として機能します。ガラス底培養皿のよく収まる PDMS ベースを確認します。 バイアル壁から放浪の 3 令幼虫を選択します。4.5 倍率光学ステレオ顕微鏡を使用して、幼虫を背側と PDMS 円筒底面配置を視覚化します。 使用する曲線し、口フック、前気門を拡張する 2 つの頭と 2 つの後部気門の間、肛門の上尾 minutien ピンを固執するピンセットします。固定化の幼虫に室温でシュナイダーの昆虫媒体の 40 μ L を追加します。注: (HL3 または HL6) Hemolyph のようなソリューションは、シュナイダーのソリューション32,33の代わりにも使用可能性があります。 壁の正中に切開に minutien ピンの使用によって幼虫の腹部体壁の背側でアクセスを提供します。 体壁を切るに使用春はさみを切開ポイントから開きます。前後方向34で正中線に沿ってカットします。 微細鉗子を使用し、春の幼虫を独特にはさみ: 唾液腺、気管や腸など内臓を削除します。シュナイダーの昆虫の中で 2 回幼虫を洗います。 微細鉗子で 2 体壁フラップを保持、穏やか、それらをストレッチして、それぞれの側に 2 つの minutien ピンをスティックします。これは六角形の準備 (図 2 a) を生成する必要があります。 イメージ投射; 中に筋肉の動きの可能性を減少する春のはさみを使用して腹側神経索から脳をデタッチします。これはまた平らなイメージングの料理準備を保持するために提供しています。PDMS ベースにすべての六つの minutien ピンをプッシュするのに、ピンセットを使用します。注: 腹壁内のピンの小さな部分だけを埋め込む必要があります。 幼虫が、術を生存していることを確認は、やや腹側神経索を突く、これは幼虫の腹部壁の蠕動収縮を引き出す必要があります。 3. やや斜め照明単一粒子追跡顕微鏡 ガラス底培養皿に切り裂かれた幼虫 PDMS ベースを反転します。室温シュナイダー昆虫媒体 (図 2 b) の 2 mL でイメージングの皿を満たし。 腹筋 6 と 735 63 x を使用してシナプスの 2 番目と 3 番目のセグメントの運動ニューロンを検索/1.2 蛍光の全内部反射蛍光 (TIRF) 顕微鏡の NA 水浸対物レンズです。 顕微鏡の接眼レンズを使用して切り裂かれた幼虫; を検索明視野照明の使用によって筋 6 を識別します。 顕微鏡取得ソフトウェアを使用 (材料の表を参照)、全反射構成で浸透深さを増加する、それ以外の場合全反射臨界角から斜めの照明を達成するために移動を 1 ° コリメータ カメラ アングルまでスライドさせます。 緑の mEos2 を視覚化する 488 nm レーザーをオンに。低いレーザー力を使用 (22.8 の 5% 未満 mW) 緑の蛍光性を漂白を避けるために。(これは文字列のビーズのように見える) 神経筋接合部を検索し、全反射する、低解像度の画像を取得します。 同時に 405 nm レーザーのスイッチ (緑から赤の種の photoconverts の mEos2) 561 nm のレーザー (画像 photoconverted 赤 mEos2) 確率的単一 mEos2 蛍光蛋白質を集中させる。注: 405 nm レーザの低消費電力の使用は推奨 (4.78 の 0.9% に 0.005 mW) 映画集録時に比較的一定光電率のことができます。50 と 75 1 nm レーザーの間 (20.1 mW)、これは周囲の神経筋接合部、筋肉組織の形態に悪影響せず赤 mEos2 種からの蛍光性を取得するための十分な。 各神経筋接合部チェーン シリーズ以上で構成される 15,000 フレーム 33 Hz」下車 as.czi 形式保存可能な参照の付属メタ データを保存するために時間を取得します。 ‘.Czi’ 映画ファイルを「.tiff」ファイルに変換するのに ImageJ を使用します。 フィジー/ImageJ37トラッキング解析ソフトウェア11,14,36 TrackMate など適切な分子を取得した映画を分析 (材料の表を参照してください)。’X’ と ‘y’ を検索各ローカライズ強度ポイントのガウスのフィットでの座標分布関数 (PSF)。注:トラブルシューティング: 緑色蛍光を観測されていないか、または 488 nm レーザーへの露出に神経筋接合部が暗すぎる場合は簡単に、photoconverting とレーザー イメージングをオン (405 nm と 561 nm) これは赤いのより多くを作り出すを助けるように、mEos2 の種。488 nm レーザーに切り替えてし、TIRF 画像を取る。 4. 単一分子局在固定幼虫 パームを介してタンパク質ナノクラ スターのサイズを測定、定着剤 – リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で希釈した 4% パラホルムアルデヒドで郭清後シュナイダーの昆虫媒体を交換してください。 室温で 30 分間幼虫を孵化させなさい。 削除解剖ピンし、固定の幼虫が、1.7 mL クリア スナップ ロック遠心チューブです。 解剖し、修正は他の多くの幼虫、必要に応じて、それら 3 回 PBS で洗浄します。 PBS をブロック バッファー (PBS、0.1% トリトン X-100 および 3% のヤギ血清のソリューション) に置き換えます。 3 回は、PBS で幼虫を洗浄し、(ブロック緩衝液で希釈した) 必要な一次抗体とインキュベートします。 4 oc. で一晩インキュベートします。 PBS に幼虫を 3 回洗浄し、(ブロック緩衝液で希釈した) 必要な二次抗体とインキュベートします。 PBS に幼虫を 3 回洗いは、PDMS ベース、およびイメージの単一分子追跡のため前述のように幼虫を取り付けます。