في فيفو تتبع في محطة Presynaptic الأعصاب الحركية المورفولوجية جزيء واحد
Summary
هنا توضح لنا كيف جزيء واحد التعريب تنشيط صور مجهرية يمكن الاضطلاع على المحطة الطرفية الأعصاب الحركية ليعيش melanogaster المورفولوجية الثالثة instar اليرقة.
Abstract
عدد متزايد من تقنيات مجهرية فائقة القرار تساعد على الكشف عن الآليات التي تحكم العالم النانوي الخلوي. تصوير جزيء واحد تكتسب زخما لأنه يوفر الوصول الاستثنائي إلى تصور الجزيئات الفردية في الخلايا الحية. هنا، يمكننا وصف أسلوب الذي قمنا بتطوير أداء تتبع الجسيمات أحادية المنشط صور التعريب مجهرية (سبتبالم) في اليرقات المورفولوجية . الاتصالات متشابك يعتمد على البروتينات بريسينابتيك الرئيسية التي تعمل بالارساء، فتيلة، وتعزيز الانصهار التي تحتوي على ناقل عصبي حويصلات مع غشاء البلازما. مجموعة من تفاعلات البروتين البروتين والدهن البروتين محكم ينظم هذه العمليات والبروتينات بريسينابتيك ولذلك يحمل تغييرات في الحركة المرتبطة بكل من هذه الأحداث الرئيسية. التحقيق في كيفية التنقل من هذه البروتينات يرتبط بوظيفتها الفسيولوجية في الحيوانات حية سليمة أمر ضروري لفهم هذه الآلية الدقيقة للعمل. استخراج البروتين التنقل مع دقة عالية في فيفو يتطلب التغلب على قيود مثل الشفافية الضوئية، وإمكانية الوصول، وعمق الاختراق. يصف لنا كيف instar البروتينات الفلورية فوتوكونفيرتيبلي معلم للبروتين بريسينابتيك سينتاكسين-1A يمكن تصور عبر الإضاءة المائلة طفيف وتعقبها في المحطة الطرفية الأعصاب الحركية أو على طول إكسون العصبون الثالثة المورفولوجية يرقة.
Introduction
الاتصالات العصبية تعتمد على إطلاق سراح العصبي، الذي يحدث من خلال التنظيم الانصهار التي تحتوي على ناقل عصبي حويصلات متشابك مع غشاء البلازما1. هذه العملية تسمى الرقابة2،،من34،،من56 ديناميكية للغاية ويمكن أن تنظم أعلى أو أسفل وفقا للتقلبات في معدل التحفيز7. البروتينات المشاركة في هذه العمليات تخضع البراونية، وعرض ذلك نانومترى منظمة قادرة على الحفاظ على طائفة من ربط الإجراءات التي ترتكز عليها هذه الوظائف الفسيولوجية. بروتينات الغشاء البلازما ديناميكية للغاية، السماح بالتراكب الجانبي الجزيئات في nanoclusters على غشاء البلازما7،،من89،10،11، 12. على هذا النحو، التحقيق في التنقل من هذه البروتينات تساعد على توضيح طريقة العمل8. البروتينات متشابك مثل قابل للذوبان اثيلماليميدي ن العوامل الحساسة مرفق البروتين مستقبلات (الافخاخ)، على سبيل المثال سينتاكسين-1A، من المعروف الآن أن يحمل التنقل الأفقي السريع، فضلا عن الوحشي الملائمة داخل nanoclusters التي قد تخدم الجزيئية مستودعات ومواقع لحويصلة الانصهار9،13،،من1415.
التطور الأخير للبروتينات الفلورية فوتوكونفيرتيبلي، مثل أحادي (m) ايوس16،17 و18من كايد، سمح القرار نانومترى البروتينات غشاء البلازما الخلايا العصبية عن طريق استخدام نهج هذه كالتعريب تنشيط صور مجهرية (النخيل) والتعمير البصرية العشوائية مجهرية (العاصفة)14،،من1519. وقد مكنت هذه التطورات التحقيقات في التنقل ونانوكلوستيرينج من البروتينات البيولوجية في استزراع الخلايا الحية والخلايا العصبية. في الآونة الأخيرة، وقد أجريت دراسات توضيح (بدقة عالية مماثلة) ديناميات وتنظيم هذه البروتينات الغشاء في الخلايا العصبية للكائنات الحية سليمة مثل موس موسكولوس، ايليجانس كاينورهابديتيس، و Melanogaster المورفولوجية14،20،،من2122.
التحقيق لمنظمة البروتين في الجسم الحي وديناميات يتطلب ليس فقط استخدام أدوات التصوير المتقدمة مؤخرا القرار فائقة (مثل النخيل، والعواصف، وفوتوكونفيرتيبلي فلوروفوريس)، ولكن أيضا القدرة على التغلب على العوائق مثل هذه كإمكانية الحصول على البروتين، وعمق تغلغل الليزر التصوير. التصوير البروتينات داخل الخلية في حيوان سليمة أصلاً صعبة كما التصوير البروتينات في هياكل مضمن عميقة داخل الأنسجة الحية للحيوان سليمة، مثل الحصين الماوس سليمة. ومن ثم فهي أكثر سهولة تصويرها البروتينات في أو بالقرب من سطح الأنسجة. وهناك صعوبة أخرى مع التصوير في فيفو ضمان إمكانية تكرار نتائج عبر الحيوانات. كما التشريح قد تختلف عن عينة واحدة إلى أخرى، تحديد هيكل بسهولة من النسخ المتماثل في مختلف العينات الحيوانية سليمة يمكن أن يكون أيضا تحديا. استخدام الهياكل النمطية، مثل synapses، والمساعدة في التغلب على بعض هذه الصعوبات.
الدراسات التي أجريت مؤخرا قد تصويرها التنقل البروتين في الحيوانات مع البشرة شفافة بصريا مثل ايليجانس كاينورهابديتيس22، بينما التحقيقات الأخرى يكون تصويرها المنظمة البروتين على السطح النسيج/الجهاز، على سبيل المثال تصوير أكتين في الخلايا العصبية القشرية عن طريق الجمجمة الماوس يعيش21. وفي بعض الحالات، استخدمت المسكنات لإبقاء الحيوان متحرك؛ ومع ذلك، المسكنات محددة قد تؤثر سلبا على بروتين الفائدة. ولذلك ينبغي استكشاف وسائل بديلة للحفاظ على الحيوانات غير متحرك خلال في فيفو تصوير للتقليل من الأخطاء.
تحذير آخر للقرار فائقة التصوير في فيفو هو أن الليزر المستخدمة لإلقاء الضوء على بروتينات الفائدة يمكن أن تؤثر سلبا على الأنسجة المحيطة، ويوصي بحفظ ومن ثم شدة الإثارة منخفضة قدر الإمكان. إضاءة الأنسجة المحيطة بالليزر يميل أيضا إلى زيادة الإشارات الخلفية. استخدام الإثارة منخفض الكثافة يساعد في الحد من الخلفية، والتحذير بأنه يمكن أن يؤدي أيضا إلى انخفاض في العائد فوتون بروتين فلوري. الطرح الخلفية أثناء التحليل يمكن أن تستخدم كوسيلة بديلة لتقليل الإشارات الخلفية قبل تحليل الصور.
المورفولوجية يعرض الكائن حي مثالي للتصوير في فيفو كما أنه يوفر الأدوات الوراثية الراسخة لتحقيق وظيفة البروتين محددة. تسلسل تفعيل المنبع (UAS)-Gal4 نظام يتيح التعبير الزماني والمكاني للبروتينات، وذلك يمكن استخدامها للتعامل مع23من كبيرة، حيث أن التحفيز الحراري الجينية المورفولوجية عابر باستخدام الأسرة الفرعية المحتملة مستقبلات A1 (dTRPA1)24 أو علم البصريات الوراثية التحفيز باستخدام كشريمسون فر تحول ريد25 يمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع التصوير14. أننا تغلبنا على العديد من المضاعفات الناجمة عن أداء في فيفو تصوير جزيء وحيدة في هذا النظام والآن تصف كيف يمكن القيام تتبع الجسيمات أحادية في يرقات الطور الثالث melanogaster المورفولوجية .
Protocol
Representative Results
Discussion
ويصف هذا البروتوكول تتبع جزيء واحد من البروتينات معلم mEos2 عند تقاطع العضلية اليرقة الطور الثالث المورفولوجية . لتجنب التعبير المفرط للبروتين المحورة وراثيا، كان يقودها التعبير سينتاكسين-1A-mEos2 الذاتية سينتاكسين-1A المروج. الدراسات المتعلقة بالتنقل البروتين متشابك معظمها كانت محدودة للتحقيقات في المختبر من استزراع الخلايا والخلايا العصبية القشرية9،11،،من1213. ما إذا كانت هذه البروتينات يحمل تواقيع التنقل مماثلة في الحيوانات حية غير معروف إلى حد كبير. تصور التنقل البروتين وحيد في فيفو، لها قيود مثل العمق الضوئي الشفافية، وإمكانية الوصول، وتغلغل يتعين التغلب عليها. تشريح إعداد اليرقات وتصور الوصلات العصبية العضلية مضمن على سطح العضلات، علينا أن نتجنب مسألة الشفافية الضوئية وسهولة الوصول إليها. باءت بالفشل محاولات صورة جزيء واحد التنقل في التكوين TIRF العادية. ومع ذلك، يتيح استخدام الإضاءة منحرف قليلاً لزيادة الإثارة الليزر اختراق العمق. وعلاوة على ذلك، ساعد مينوتين دبابيس تستخدم لشل اليرقة لتجنب أي أثر سلبي ممكن استعمال مخدر على التنقل البروتين. من الممكن استخدام أعلى التكبير الأهداف، مثل 100 × أهداف الغمر النفط، إلى تصور جزيئات مفردة في فيفو. ومع ذلك، قد يزيد التكبير زيادة حدوث الانجرافات خارج التركيز. وبالإضافة إلى ذلك، لدينا وتستخدم كثافة أقل (~ 30%) 561 نانومتر الليزر بنجاح إلى جزيئات صورة واحدة في محطات الأعصاب الحركية. قد يلزم إجراء اختبارات إضافية لاستخدام طاقة الليزر أقل.
هذا البروتوكول مناسبة لتصور تنقل البروتينات متشابك داخل بقرب غشاء البلازما الخلايا العصبية. باستخدام هذا النهج، كانت تنقل البروتين الفخ-سينتاكسين-1A وأوتوفاجوسومي ملزمة البروتين Atg18a-14،بنجاح المصورة فيفو في26. تنقل البروتينات في الخلايا العصبية الحركية ويمكن أيضا أن تكون محاور عصبية التحقيق27. ومع ذلك، قد يصعب التحقيق في تنقل البروتينات في الدماغ أو الحبل البطني العصب لتقييم سبب إشارة خلفية عالية تنتجها الأنسجة الكامنة؛ وباﻹضافة إلى ذلك، تصور التنقل البروتين في نفس بنية الدماغ سوف يتطلب فلوريسسينتلي علامات بنية الدماغ (لضمان قابليتها للتكرار)، ويتطلب الاستخدام المزدوج-كاميرا التصوير.
الأساليب الحالية المتاحة للفحص المجهري القرار فائقة في المورفولوجية معظمها يقتصر على تصوير الأجنة، بدلاً من الأكثر نمواً يرقة الطور الثالث38،39. المشكلة الرئيسية مع هذه البروتوكولات هو أنها تسفر عن عدد قليل من المسارات في منطقة تصويرها، وبالتالي الحيلولة دون إجراء تحليل متعمق لتنقل الدول22،40. لدينا في فيفو جزيء واحد تتبع بروتوكول لديه القدرة على توليد عدد كبير من المسارات، ولذلك يمكن أن تستخدم في نماذج حيوانية أخرى مثل كاينورهابيديتيس ايليجانس والزرد. وفي الواقع، ولدت كل سلسلة NMJ مسارات ~ 2,400 يجعلها مناسبة لتحليل مختلف الدول المتنقلة والتحولات بين هذه الدول14،27. بالإضافة إلى ذلك، في فيفو جزيء واحد التصوير استراتيجيات كثيرة تعتمد على استخدام المسكنات شل الحيوانات20،22، الذي قد يغير الوظيفة الفسيولوجية التي يتم التصوير. هنا نحن الأمثل على بروتوكول ‘خالية من التخدير’ لشل اليرقات باستخدام دبابيس مينوتين.
قد يكون احتمال استخدام هذا البروتوكول لتصور تنقل البروتينات في ثلاثة أبعاد. التقدم الذي أحرز مؤخرا في مجهرية فائقة القرار السماح بالتنقل البروتين تصور في المختبر في ‘x’، ‘نعم’، و ‘z’ أبعاد41،42. غير حساب أسلوبنا الحالي لتنقل البروتينات في محور ‘z’. بعد المورفولوجية موتور الأعصاب الطرفية هيكل كروي وسيكون نهج مستقبل قيماً تحديد كمية البروتين التنقل في حجم ثلاثي الأبعاد43. من الممكن تصوير في z-البعد باستخدام عدسة أستيجماتيك. بدلاً من ذلك، في وضع TIRF44،45، كما يتم زيادة z-القرار. ومع ذلك، في تجاربنا، استخدمنا الإضاءة منحرف قليلاً تصور الجزيئات واحدة من syntaxin1A-mEos2 دون عدسة أستيجماتيك.
وفي الختام، معلم توافر كلا المعدلة وراثيا المورفولوجية ذبابة الأوراق المالية معربا عن البروتينات مع بروتين فوتوكونفيرتيبلي، PDMS قاعدة تشريح اليرقة المحورة وراثيا، فضلا عن مجهر TIRF مزودة بإمكانية تغيير زاوية الإضاءة هي أهم الأدوات اللازمة لتصور البروتينات واحد كما هو موضح في هذا البروتوكول.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر سبارتا جان-باتيست وشوكت دانيال (المعهد، يزار التابع لجامعة بوردو) على دعمهم الكريم مع تحليل جزيء واحد. ونشكر خصوصا بالماس نك وجيسيكا مكجاو (QBI، جامعة كوينز لاند) لمساعدتهم مع الفيديو تسجيل التعليق الصوتي، فضلا عن الشكل تصميم الرسوم البيانية. هذا العمل كان يدعمها المشروع اكتشاف مجلس البحوث الأسترالية (ع) (DP170100125 إلى F.A.M.)، “مجلس البحوث الأسترالي” (LE0882864 منحة بشرية إلى F.A.M.)، “مستقبل الزمالة” (FT100100725 إلى B.V.S.)، “مجلس البحوث الأسترالية” (منحة بشرية LE130100078 إلى F.A.M). ومنح “تمويل المشروع” (APP1103923 إلى B.V.S.). F.A.M. وهو زميل أبحاث كبار NHMRC (ONT1060075).
Materials
| PDMS (Sylgard 184 silicone elastomer kit) | Dow Corning Corporation | 000000000001064291 | |
| Glass-bottomed Culture Dish | In Vitro Scientific | D29-20-1.5-N | |
| Optical Stereo-microscope | Olympus | SZ51 | |
| Curved Tweezers (Style 5/45) | Electron Microscopy Sciences | 0208-5AC-PO | |
| Minutien Pins (0.1mm) | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Schneider's Insect Medium | Sigma, Life Sciences | S0146 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Fine Forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| ELYRA PS.1 Microscope | Zeiss | PS.1 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-515Q | |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| Normal Goat Serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Maxyclear snaplock microcentrifuge Tube (1.7 mL) | Axygen | MCT-175-C | |
| Zen Black acquisition software | Carl Zeiss, 2012 | ||
| Metamorph software | Molecular Devices | 7.7.8 | PALM Tracer Plugin |
| Fly strain | w1118; HA-Sx1A-mEos2 | ||
References
- Sudhof, T. C. The molecular machinery of neurotransmitter release (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 53 (47), 12696-12717 (2014).
- Papadopulos, A., et al. Activity-driven relaxation of the cortical actomyosin II network synchronizes Munc18-1-dependent neurosecretory vesicle docking. Nat Commun. 6, 6297 (2015).
- Papadopulos, A., Tomatis, V. M., Kasula, R., Meunier, F. A. The cortical acto-Myosin network: from diffusion barrier to functional gateway in the transport of neurosecretory vesicles to the plasma membrane. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 153 (2013).
- Tomatis, V. M., et al. Myosin VI small insert isoform maintains exocytosis by tethering secretory granules to the cortical actin. J Cell Biol. 200 (3), 301-320 (2013).
- Wen, P. J., et al. Phosphatidylinositol(4,5)bisphosphate coordinates actin-mediated mobilization and translocation of secretory vesicles to the plasma membrane of chromaffin cells. Nature Communications. 2, (2011).
- Malintan, N. T., et al. Abrogating Munc18-1-SNARE complex interaction has limited impact on exocytosis in PC12 cells. J Biol Chem. 284 (32), 21637-21646 (2009).
- Choquet, D., Triller, A. The dynamic synapse. Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).
- Triller, A., Choquet, D. New concepts in synaptic biology derived from single-molecule imaging. Neuron. 59 (3), 359-374 (2008).
- Gandasi, N. R., Barg, S. Contact-induced clustering of syntaxin and munc18 docks secretory granules at the exocytosis site. Nat Commun. 5, 3914 (2014).
- Milovanovic, D., Jahn, R. Organization and dynamics of SNARE proteins in the presynaptic membrane. Front Physiol. 6, 89 (2015).
- Kasula, R., et al. The Munc18-1 domain 3a hinge-loop controls syntaxin-1A nanodomain assembly and engagement with the SNARE complex during secretory vesicle priming. J Cell Biol. 214 (7), 847-858 (2016).
- Constals, A., et al. Glutamate-induced AMPA receptor desensitization increases their mobility and modulates short-term plasticity through unbinding from Stargazin. Neuron. 85 (4), 787-803 (2015).
- Ribrault, C., et al. Syntaxin1A lateral diffusion reveals transient and local SNARE interactions. Journal of Neuroscience. 31 (48), 17590-17602 (2011).
- Bademosi, A. T., et al. In vivo single-molecule imaging of syntaxin1A reveals polyphosphoinositide- and activity-dependent trapping in presynaptic nanoclusters. Nat Commun. 8, 13660 (2017).
- Bar-On, D., et al. Super-resolution imaging reveals the internal architecture of nano-sized syntaxin clusters. J Biol Chem. 287 (32), 27158-27167 (2012).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
- Zhang, M. S., et al. Rational design of true monomeric and bright photoactivatable fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (7), 727-U297 (2012).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Schneider, R., et al. Mobility of calcium channels in the presynaptic membrane. Neuron. 86 (3), 672-679 (2015).
- Berning, S., Willig, K. I., Steffens, H., Dibaj, P., Hell, S. W. Nanoscopy in a living mouse brain. Science. 335 (6068), 551-551 (2012).
- Willig, K. I., et al. Nanoscopy of filamentous actin in cortical dendrites of a living mouse. Biophys J. 106 (1), L01-L03 (2014).
- Zhan, H., et al. In vivo single-molecule imaging identifies altered dynamics of calcium channels in dystrophin-mutant C. elegans. Nat Commun. 5, 4974 (2014).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist’s Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Vanhauwaert, R., et al. The SAC1 domain in synaptojanin is required for autophagosome maturation at presynaptic terminals. EMBO J. , (2017).
- Joensuu, M., et al. Subdiffractional tracking of internalized molecules reveals heterogeneous motion states of synaptic vesicles. J Cell Biol. 215 (2), 277-292 (2016).
- Merhi, A., Gerard, N., Lauwers, E., Prevost, M., Andre, B. Systematic mutational analysis of the intracellular regions of yeast Gap1 permease. PLoS One. 6 (4), e18457 (2011).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (9), 3312-3317 (2007).
- Stewart, B. A., McLean, J. R. Population density regulates Drosophila synaptic morphology in a Fasciclin-II-dependent manner. J Neurobiol. 61 (3), 392-399 (2004).
- Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).
- Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J Neurophysiol. 88 (5), 2659-2663 (2002).
- Halachmi, N., Nachman, A., Salzberg, A. Visualization of proprioceptors in Drosophila larvae and pupae. J Vis Exp. (64), e3846 (2012).
- Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
- Nair, D., et al. Super-resolution imaging reveals that AMPA receptors inside synapses are dynamically organized in nanodomains regulated by PSD95. J Neurosci. 33 (32), 13204-13224 (2013).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Ferguson, J. P., et al. Deciphering dynamics of clathrin-mediated endocytosis in a living organism. J Cell Biol. 214 (3), 347-358 (2016).
- Greiss, F., Deligiannaki, M., Jung, C., Gaul, U., Braun, D. Single-Molecule Imaging in Living Drosophila Embryos with Reflected Light-Sheet Microscopy. Biophys J. 110 (4), 939-946 (2016).
- Robin, F. B., McFadden, W. M., Yao, B., Munro, E. M. Single-molecule analysis of cell surface dynamics in Caenorhabditis elegans embryos. Nat Methods. 11 (6), 677-682 (2014).
- Singh, A. P., et al. 3D Protein Dynamics in the Cell Nucleus. Biophys J. 112 (1), 133-142 (2017).
- Perillo, E. P., et al. Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination. Nat Commun. 6, 7874 (2015).
- Knodel, M. M., et al. Synaptic bouton properties are tuned to best fit the prevailing firing pattern. Front Comput Neurosci. 8, 101 (2014).
- Yang, Q., Karpikov, A., Toomre, D., Duncan, J. Estimation of 3D geometry of microtubules using multi-angle total internal reflection fluorescence microscopy. Med Image Comput Comput Assist Interv. 13 (Pt 2), 538-545 (2010).
- Boulanger, J., et al. Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (48), 17164-17169 (2014).
