Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS!

Cl&#233;mence Simon; Corentin Spriet; Simon Hawkins; Cedric Lion

doi:10.3791/56947

JoVE Journal > Chemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Chimie

להמחיש Lignification Dynamics בצמחים עם לחץ על כימיה: תיוג כפולה היא האושר!

Published: January 26, 2018

doi:

10.3791/56947

Clémence Simon¹, Corentin Spriet¹, Simon Hawkins¹, Cedric Lion¹

¹UGSF – Unité de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle, CNRS, UMR 8576,Université de Lille

Summary

בליס, פרוטוקול תיוג כפול ללמוד דינמיקה lignification, פותחה. שימוש monolignol סינתטי כתבים ושילוב רציפים של bioorthogonal SPAAC, CuAAC לחץ תגובות, מתודולוגיה זו סוללת את הדרך כדי ניתוח מעמיק של הגורמים המסדירים את להן של lignins ב הפיסקו.

Abstract

ליגנין הוא לאחד biopolymers הנפוץ ביותר על פני כדור הארץ, מרכיב עיקרי של ביומסה lignocellulosic. זה פולימר בעל תאים פנוליים ממלא תפקיד חיוני הגנה מבניים בתחום הפיתוח החיים של צמחים. למרות מורכבות מנגנוני ויסות lignification תהליכים ויוו חריפה להשפעה של valorization תעשייתי של מוצרים רבים הצמחי, הקהילה המדעית יש עדיין דרך ארוכה ללכת בשביל לפענח אותם. ב- 3 שלבים פשוטים זרימת עבודה, פרוטוקול תיוג כפול שהוצגו במסמך זה מאפשר bioimaging מחקרים של פעיל lignifying אזורי של רקמות הצמח. הצעד הראשון מורכב ב שיתוף מטבולית של שני עיתונאים כימי עצמאית, המחליפים של שני monolignols מקורי כי להצמיח ליגנין H-G-יחידות. לאחר שהשתלבה גדל ליגנין פולימרים, כל כתב אז במיוחד תווית משלו בדיקה פלורסנט באמצעות שילוב רציפים של bioorthogonal SPAAC/CuAAC לחץ על תגובות. בשילוב עם autofluorescence ליגנין, גישה זו מובילה הדור של מפות תלת-צבעי לוקליזציה של ליגנין בתוך קירות התא הצמח על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי פלורסצנטיות, מספק מידע מדויק המרחבי על נוכחות או היעדרות של פעיל מכונות lignification-קנה המידה של צמח רקמות, תאים ושכבות שונות דופן התא.

Introduction

בשני העשורים האחרונים, האסטרטגיה כתב כימי התפתחה מתודולוגיה שני שלבים חזק כדי לחקור את הדינמיקה ואת הפונקציות של מולקולות שאינן גנטית מקודד. ¹ ^, ² ^, ³ באסטרטגיה אנלוגי סינתטי של biomolecule עניין עם אפנון קטן – כתב כימי – עובר תחילה מטבוליזם האורגניזם החי, ולאחר מכן בדיקה כימית (למשל., fluorophore על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה קונפוקלית הדמיה) קשורה covalently הכתב incorporated ויה bioorthogonal לחץ על כימיה. המכשיר חייב להגיב במהירות, במיוחד עם השינוי כימי הציג בעת היותו אינרטי כדי כל מולקולות נוכח במערכת החיים. במובנים רבים, שיטה זו גוברת על המגבלות של טכניקות נפוצות bioconjugation באמצעות לחץ ספציפי מאוד כימיה ligations ובכך מספק הזדמנות לעקוב מטבוליטים או ובמקרו-מולקולות ביולוגיות כי היו נגישים בעבר חי מערכות⁴^,⁵^,⁶.

למרות הפופולריות בצמיחה מהירה של שיטה זו עוצמה של תאים חיידקיים ובעלי חיים, דוחות המתאר את השימוש בביולוגית הצמח הם כמה מפתיע, המרחק בין⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^, ¹¹^,¹². היינו מעוניינים במיוחד ליישם אסטרטגיה זו בצמחים ללמוד היווצרות של ליגנין, לאחד biopolymers הנפוץ ביותר על פני כדור הארץ, מרכיב עיקרי של ביומסה lignocellulosic. ¹³ ^, ¹⁴ ליגנין הוא פולימר בעל תאים פנוליים זה ממלא תפקיד חיוני הגנה מבניים בתחום הפיתוח החיים של צמחים.

הוא בדרך כלל מורכב moieties 4-hydroxyphenylpropanoid שלושה: H (p– hydroxyphenyl), G (guaiacyl) ויחידות S (syringyl) נגזר בהתאמה בין 3 ‘monolignols’ (p– coumaryl, coniferyl ו- sinapyl כהלים) כי הם מסונתז דרך השביל phenylpropanoid בציטופלסמה של התא (איור 1). לאחר להיות מיוצא דופן התא, monolignols הם מחומצן לקיצוניים peroxidases או laccases לאחר מכן הם עוברים צימוד הרדיקלי גרידא כימי תגובות פולימריזציה כדי ליגנין פולימרים, תהליך הנקרא lignification. ¹⁵ ^, ¹⁶ למרות lignins חריפה להשפיע על valorization תעשייתי של רבים הצמחי מוצרים, הקהילה המדעית יש עדיין דרך ארוכה ללכת כדי לפענח את המנגנון הסבוך ויסות lignification לו.

איור 1: תהליך lignification בתאי צמח. Monolignols הם biosynthesized של פנילאלנין ב ציטוזול. לאחר להיות מיוצא דופן התא, monolignols הם מחומצן לקיצוניים peroxidases או laccases לאחר מכן הם עוברים צימוד הרדיקלי גרידא כימי תגובות פולימריזציה כדי ליגנין פולימרים, תהליך הנקרא lignification. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

למרות דיווחים על השימוש bioorthogonal תגובות לניתוח glycan רבים,²^,³^,¹⁷ שלהם יישום דוגמאות לסוגים אחרים של מולקולות הן פחות. השימוש bioorthogonal כימיה למטרות bioimaging ליגנין רק לאחרונה היה חלוץ ידי. Tobimatsu et al. ⁸ ב תודרנית לבנה כדי לספק מידע אודות שילוב של coniferyl המחליפים אלכוהול לתוך הפולימר ליגנין איפה זה יוצר את יחידות G,⁸^,⁹ ובכך הממחיש את הוכחת את זה כתב כימי אסטרטגיות ישימות בהקשר זה. השימוש CuAAC היה ללמוד גם באמצעות נגזרת אלכוהול שונים coniferyl חודש כמה מאוחר יותר בוקובסקי ואח. ⁹ . אולם, ליגנין מכיל גם יחידות H ו- S הבנה עמוקה יותר של תהליך lignification דורש יותר ידע איך כל monolignols משולבים הפולימר, מה הגורמים עשויות לשלוט הקומפוזיציה שלה. הפיתוחים החדשים בתחום זה כיום תלויים פיתוח מתודולוגיות יעיל כדי לעקוב אחר כתבים כימיות מרובות בו-זמנית במערכות החיים. אף-על-פי כמה כתבות על glycans הניחו את היסודות בשנים האחרונות¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²², כפול תיוג גישות נשארים אתגר גדול ב bioorthogonal כימיה. אם פרוטוקול לחץ לשחזור תיוג-יחיד הוא קשה לפתח, ואז כפול תיוג גישות הדורשים אופטימיזציה במשולב שני הדדית תואמת bioorthogonal תגובות על שני הכתבים כימיים נפרדים הם אפילו יותר קשה. כמה דוגמאות כי חלוץ היבט זה השתמשו בשילוב של אזיד-אלקין אתקרב זן cycloaddition (SPAAC) ותגובות תגובת דילס-אלדר (DA_inv) דרישה אלקטרונית הופכי אלקן-tetrazine ללמוד glycans בתאים בעלי חיים. עם זאת, חשבנו כי bioorthogonality התגובה DAinv לא יכול להיות מובטח ביישום זה בשל המאפיינים המבניים של ליגנין (אשר מורכב של מונומרים אלקטרון-עשיר cinnamyl שהוחלפו מסוג זה יכול להגיב עם אלקטרון עלוב האוויר דינס כגון הגששים tetrazine המשמש בתגובות DAinv), כי זה עלול לייצר שאינם ספציפיים תיוג. בנוסף, התגובה_inv DA דורש ידיות כימיים קשים לאכסון גישה, כמו גם להיות מגושם ולא lipophilic ובכך מעלים את האפשרות כי הקצב של התאגדות, תחבורה ו/או לוקליזציה של החומר הכימי כתב ויוו עלולים להיות מושפעים. כפי שקלנו כי ההיבט האחרון היה רלוונטי במיוחד במקרה של גישה כימיה בלחיצה ללמוד lignification, אנחנו בחרה בכיוון שונה ופיתח באמצעות Bioorthogonal מצדו הדמיה רציפים אסטרטגיה (אושר) שילוב של Cycloaddition אזיד-אלקין Strain-Promoted (SPAAC) ו- Cycloaddition אזיד-אלקין קטליזת של נחושת (CuAAC) ויוו. ²³

תגובות שני אלו הם אכן שני bioorthogonal הראשי לחץ על תגובות בהן השתמשו עד כה, יותר בפרט כמה דוגמאות של ליגנין הדמיה אשר פורסמו לאחרונה. ⁸ ^, ⁹ אסטרטגיית תיוג כפול שלנו מאפשרת את השימוש של אזיד moiety על monolignol אחד כתב וידיות של אלקין מסוף מצד שני, שני הכימי i) אינרטיים לכיוון מבנים רלוונטי מבחינה ביולוגית, ii) מאוד קטנים בגודלם (איור 2 ). כתוצאה, ההשפעה של אלה שינויים סינתטי על המאפיינים physicochemical של biomolecule שנבחנה ממוזער ובכך להקטין אפשרי אי-התאמות בין סובסטרטים לא טבעיים, הטבעית monolignol מבחינת תחבורה, metabolization המחירים במהלך השלב התאגדות מטבולית. למרות השילוב של SPAAC ו- CuAAC נראה מאוד אינטואיטיבי במבט ראשון, זה לידע שלנו רק הדוגמה השניה של סימון כפול באמצעות אסטרטגיה זו לבין היישום הראשון על מבנים שאינם glycans. ¹² ^, ²³

איור 2: אושר כפול תיוג אסטרטגיה. כתבים כימי H_AZ G_ALK מתויג אנלוגים של monolignols מקורית H ו- G בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. הם משולבים קודם פולימרים ליגנין הגוברת של קירות התא על ידי האכלת אקסוגני (שלב 1). Cyclooctyne – ו אזיד-functionalized הגששים פלורסנט ואז ברצף מאתרים בפני הכתבים incorporated מאת bioorthogonal לחץ על כימיה: התגובה SPAAC (שלב 2) הוא מאוד ספציפי של יחידות H_AZ , ואחריו (התגובה CuAAC שלב 3) זה מפורט של G_ALK יחידות (שלב 3), ובכך לאפשר לוקליזציה ספציפי של שני עיתונאים באופן עצמאי במדגם זהה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

אנו ראשית המיועד לאמת את monolignol מתויג אזיד כתב H_AZ (ממלא מקום של p– coumaryl אלכוהול), קודמן של יחידות ליגנין H ו ואז המציאו את אושר כפול תיוג האסטרטגיה שבה הוא משמש במשולב עם קודם לכן דווח מתויג אלקין G_ALK,⁹ (ממלא מקום של אלכוהול coniferyl), קודמן של ליגנין G יחידות. ב פרוטוקול לשחזור זה פיתח ובחן, פשתן, זן צמח חשוב מבחינה כלכלית, שילוב מטבולית כפול של H_AZ ו- G_ALK לתוך ליגנין מושגת קודם לפני רציפים SPAAC/CuAAC תיוג. כאן, מתויג H_AZ יחידות תחילה במפורש מסומנות באמצעות מצדו SPAAC של fluorophore cyclooctyne-functionalized, ואחריו בתיווך CuAAC מצדו של בדיקה פלורסנט השני במתויג G_ALKיחידות. שיטה זו שימש לחקור את הדינמיקה של תהליכים lignification בתוך קירות התא צמח וניתן יישומית ויוו לבלום חתכים, חיים נובע, כמו גם אחרים-שתילים, מינים שונים.

Protocol

הערה: המדיה ½ MS נוזלי ומוצק חייבים להיות מוכנים מראש כפי שמתואר משלימה טבלה 1. 1. תרבית תרבות של 2 פשתה בן חודש לזרוע זרעי פשתן (Linum usitatissimum ל’) בעציצים פלסטיק באמצעות קומפוסט השתילה. לגדל זרעי פשתן בתוך תאי צמיחה ב 22 ° C עם photoperiod של 16 h/8 h יום/לילה. לצייד צמחים עם תמיכה אנכי לאחר חודש ולגדול עד 2 בן חודש. תרבות של שתילי פשתן בת שבוע 2 לעטוף את זרעי פשתן 12 בחתיכת בד גבינה ותקן עם גומייה כדי להפוך צרור.הערה: לבצע את השלבים הבאים בתנאים סטריליים ברדס fume זרימה שכבתית. מקם את הצרור זרע בבקבוק זכוכית 250 מ ל בעבר בלוק. להוסיף 70 מ ל 70% EtOH בבקבוק ובעדינות ולערבב במשך 1 דקה. הסר בזהירות את EtOH על ידי שפייה תוך השארת את הצרור בבקבוק. להוסיף 100 מ של 2% נתרן תת-כלורי ומערבבים בעדינות במשך 10 דקות. הסר את הפתרון נתרן תת-כלורי על ידי שפייה תוך השארת את הצרור בבקבוק. חזור על שלבים 1.2.5-1.2.6. להוסיף 100 מ של מים הנדסה גנטית סטרילי ומערבבים במשך 1 דקה. חזור על שלב 1.2.8 3 פעמים, על הגדלת זמן השטיפה בכל שטיפה (5, 10, 15 דקות). חם בינוני ½ MS מוצק, שפוך את זה בתיבת תרבות סטרילי צמח לגובה של 2 ס מ ולתת לו להתקרר עד התמצקות. מניחים בעדינות זרע אחד על בינוני מוצק באמצעות מלקחיים סטרילי. סגור את תיבת סטרילי. להעביר את תיבת תא הצמיחה ב 22 ° C עם photoperiod של 16 h/8 h יום/לילה גדלים השתילים פשתן עבור 2 שבועות. 2. מטבולית תיאגוד כתבים כימי הערה: שלוש גרסאות ניסיוניות מוצגים להלן: תיוג i) מטבולית של גזע חתכים, נובעת ii) כל השתילים iii) צמח. כל פרוטוקול מוצג עבור שכפול ביולוגי אחד, כמויות ניתן להתאים למספר של משכפל ביולוגי הנדרש. הפתרונות monolignol מוכנות מפתרונות מניות כי הם עשו כפי שמתואר בטבלה 2 לפני הניסוי. הפתרונות מניות ניתן לאחסן מספר חודשים ב-20 ° C. HAZ: GALK או H:G הפרופורציות יכול להיות מותאם כדי להתאים כל העיצובים ניסיוני בהזמנה אישית. כתב כימי שהשתלבה 2 חתכים גזע פשתן בן חודש להכין פתרון כתב כימי µL 300 המכיל 10 מיקרומטר של GALK ו- 10 מיקרומטר של HAZ במדיום ½ MS נוזל סטרילי. מערבולת HAZ/GALK פתרון ולהעביר אותו אחד טוב של צלחת 48-ובכן עם micropipette. להכין פתרון שליטה שלילי µL 300 המכיל 10 מיקרומטר של G ו- 10 מיקרומטר של H במדיום ½ MS נוזל סטרילי. מערבולת H/G פתרון ולהעביר אותו טוב השני באותה צלחת 48-. טוב. חותכים את הגבעול של מפעל פשתן בן חודש 2-10 ס מ מעל פני הקרקע בעזרת סכין גילוח חדש. בעדינות להכין 50 חתכים ואלכסוני ביד חופשית של הגזע באמצעות תער גילוח (כ 150-250 מיקרומטר עבה). מיד מקום חתכים של נוזל סטרילי ½ MS בינוני בכוס לצפות. בדוק חזותית, בחר ללא פגע חתכים כל ולהפיץ באופן אקראי 10 מהם ב- HAZמלא טוב /GALK פתרון. חזור על צעד 2.1.8 תגובה על מלא טוב עם H/G פתרון (כמו שליטה שלילי). חזור על צעד 2.1.8 תגובה על שליש טוב מלא µL 300 של ½ MS בינוני (כפקד רקע להתאמת הבסיס פלורסצנטיות במהלך עיבוד הנתונים הבאים של תמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית). דגירה את הצלחת באור רציף בתוך תא הצמיחה ב 20 מעלות צלזיוס במשך 20 h. הסר את הפתרון monolignol בכל טוב עם micropipette. להוסיף 500 µL של ½ MS בינוני מכל קידוח, ולערבב בעדינות במשך 10 דקות ולהסיר זה שטיפה פתרון עם micropipette. חזור על 4 פעמים והמשך בליס תיוג מיידית (סעיף 3). כתב כימי שהשתלבה 2 בן חודש שלם גבעולים זרעי פשתן להכין פתרון כתב כימי מ ל המכיל 10 מיקרומטר של GALK ו- 10 מיקרומטר של HAZ במדיום ½ MS נוזל סטרילי. מערבולת HAZ/GALK פתרון והעברת אותו במבחן הזכוכית בגובה 20 ס מצינור עם פיפטה. להכין פתרון בקרה שלילית מ ל המכיל 10 מיקרומטר של G ו- 10 מיקרומטר של H במדיום ½ MS נוזל סטרילי. מערבולת H/G פתרון והעברת אותו במבחן הזכוכית בגובה 20 ס מצינור. להכין השלישי זכוכית למבחנה המכילה 5 מ של ½ MS בינוני (כפקד רקע להתאמת הבסיס פלורסצנטיות במהלך עיבוד הנתונים הבאים של תמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית). חותכים את הגבעול של מפעל פשתן בן חודש 2-10 ס מ מעל פני הקרקע בעזרת סכין גילוח חדש. למחוק את מערכת השורשים ואת החלק התחתון של הגזע והמשך לשלב הבא עם החלק העליון של הגבעול הצמח. לטבול את הבסיס של הגזע לחתוך כל בצינור המכיל את HAZ/GALK פתרון. הצב הגבעול בפתרון הדגירה שלו מיד לאחר הסרת מערכת השורשים כדי למנוע התייבשות.הערה: אם השיטה מוחל על צמחים צעירים/מבוגר ו/או מינים אחרים, עוצמת הקול של monolignol פתרונות שתישמר לפי הגודל / גיל של הצמח וקוטר הגזע שלה. לצרף את הגבעול תמיכה אנכי כדי לשמור על הסדר. חותם את מבחנה עם מצלמות-מיקרוסקופים כדי למנוע אידוי של הפתרון. חזור על צעדים 2.2.6-2.2.9 עבור המדגם שליטה שלילי עם H/G פתרון. חזור על צעדים 2.2.6-2.2.9 עבור המדגם שליטה רקע זריחה המכיל המדיום ½ MS. דגירה כל גזע עבור 20 h באור רציף באמצעות אור ניאון. לאחר 20 h התאגדות מטבולית, להסיר את הגבעול מודגרות ב- HAZ/GALK פתרון ולשטוף אותו עם ½ MS בינוני. לחתוך, למחוק את החלק התחתון 1 ס מ של הגזע באמצעות סכין גילוח ולאחר מכן להכין צילינדר גבוה 1 ס מ מבסיס של הגזע שנותרו. בזהירות להכין 20 ביד חופשית רוחבי חתכים (כ 150-250 מיקרומטר עבה) מ זה גליל ומניחים מיד בכוס צפייה מלאה עם ½ MS בינוני. הכניסו µL 500 ½ MS בינוני אחד טוב של צלחת 48-. טוב. בדוק חזותית, בחר ללא פגע חתכים כל ולהפיץ באופן אקראי 10 מהם בתוך הבאר מלא עם ½ MS פתרון. חזור על השלבים 2.2.13-2.2.17 עבור הגזע שליטה שלילי מודגרות עם הפתרון H/G . חזור על צעדים 2.2.13-2.2.17 עבור הגזע שליטה רקע זריחה מודגרות ½ MS בינונית. הסר בזהירות את הפתרון לכל היטב עם micropipette. להוסיף 500 µL של ½ MS בינוני מכל קידוח, ולערבב בעדינות במשך 10 דקות ולהסיר זה שטיפה פתרון עם micropipette. חזור על 4 פעמים והמשך בליס תיוג מיידית (סעיף 3). כתב כימי שהשתלבה 2 שתילים פשתן בת שבועהערה: השלבים הבאים כל מתבצעת בתנאים סטריליים. להכין פתרון כתב כימית 2 מ”ל המכיל 10 מיקרומטר של GALK ו- 10 מיקרומטר של HAZ במדיום ½ MS נוזל סטרילי. מערבולת HAZ/GALK פתרון והעברת אותו במבחן הזכוכית ס מ בגובה 20 צינור עם פיפטה. להכין פתרון שליטה שלילי 2 מ”ל, המכיל 10 מיקרומטר של G ו- 10 מיקרומטר של H במדיום ½ MS נוזל סטרילי. מערבולת H/G פתרון והעברת אותו במבחן 20 ס מגבוהה זכוכית צינור. להכין השלישי הזכוכית בגובה 20 ס מלמבחנה המכילה 2 מ של ½ MS בינוני (כפקד רקע להתאמת הבסיס פלורסצנטיות במהלך עיבוד הנתונים הבאים של תמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית). להסיר בעדינות שתיל פשתן בת שבוע 2 של המדיום ½ MS מוצק בעזרת זוג מספריים ארוך (סעיף 1.2. לעיל). בעדינות להעביר שתיל הצינור המכיל את HAZ/GALK פתרון, המבטיח כי שורשיו שקועים בפתרון. סגור את מבחנה עם כובע פלסטיק כדי למנוע התאיידות. חזור על צעדים 2.3.6-2.3.8 ברכבת התחתית שליטה שלילי עם ה / G פתרון. חזור על צעדים 2.3.6-2.3.8 הצינור שליטה רקע זריחה המכיל המדיום ½ MS. דגירה כל שתיל באור רציף בחדר צמיחה עבור 20 h ב- 20 ° C. להסיר בעדינות את שתיל מודגרות ב- HAZ/GALK פתרון ולשטוף אותו עם ½ MS בינוני. בעדינות להכין חתכים ביד חופשית 20 (שנהנתם 150-250 מיקרומטר עבה) hypocotyl. הכניסו µL 500 ½ MS בינוני אחד טוב של צלחת 48-. טוב. בדוק חזותית, בחר ללא פגע חתכים כל ולהפיץ באופן אקראי 10 מהם בתוך הבאר מלא עם ½ MS פתרון. חזור על השלבים 2.3.12-2.3.15 עבור שליטה שלילי שתיל מודגרות עם הפתרון H/G . חזור על צעדים 2.3.12-2.3.15 על רקע זריחה שליטה שתיל מודגרות ½ MS בינונית. הסר בזהירות את הפתרון לכל היטב עם micropipette. להוסיף 500 µL של ½ MS בינוני מכל קידוח, ולערבב בעדינות במשך 10 דקות ולהסיר זה שטיפה פתרון עם micropipette. חזור על 4 פעמים והמשך בליס תיוג מיידית (סעיף 3). 3. קרינה פלואורסצנטית כפול תיוג דוגמאות חתך רוחב של צמחים, SPAAC, CuAAC הערה: האושר תיוג פרוטוקול זה זהה עבור כל הדגמים ניסיוני 3 (סעיף 2). אתקרב זן תיוג אזיד-אלקין Cycloaddition (SPAAC) להכין 1 מ”ל של פתרון SPAAC המכיל 5 מיקרומטר של DBCO-יתד4-5/6-carboxyrhodamine 110 במדיום ½ MS נוזל סטרילי. מערבולת הפתרון ולשמור אותו בחושך. אחרי השטיפה האחרונה צעדים של פרוטוקול התאגדות מטבולי [2.1.13, 2.2.21 או 2.3.19 בהתאם לעיצוב הניסיונית שבחרת], להסיר את המדיום ½ MS ולהוסיף 300 µL של הפתרון SPAAC לכל באר עם micropipette. מגן לוח 48-ובכן האור על ידי כיסוי ברדיד אלומיניום או הנחתו בתוך קופסה. מערבבים בעדינות את הצלחת על מטרף מכני עבור h 1 בחושך בטמפרטורת החדר. נחושת-מזורז תיוג אזיד-אלקין Cycloaddition (CuAAC) לשטוף כל טוב 4 פעמים כפי שמתואר בשלב 2.1.13 תוך שמירה על הצלחת בחושך. להכין 1 מ”ל של פתרון CuAAC המכילים 2.5 מ”מ סודיום אסקורבט, 0.5 מ מ CuSO4 ו- 5 מיקרומטר של 5-טמרה-יתד3-אזיד במדיום ½ MS נוזל סטרילי. מערבולת הפתרון ולשמור אותו בחושך.הערה: פתרון CuAAC זה חייב להיות טרי מוכן לפני השימוש, אפשרות לאחסן יותר מכמה ימים ב- 4 מעלות צלזיוס. להסיר המדיום ½ MS כל היטב ולהוסיף ישירות µL 300 של הפתרון CuAAC לכל שימוש טוב של micropipette. מערבבים בעדינות את הצלחת על מטרף מכני עבור h 1 בחושך בטמפרטורת החדר. הסר את הפתרון CuAAC משתמש של micropipette. משתמש של micropipette, להוסיף 500 µL של ½ MS, מערבבים בחושך למשך 10 דקות ולאחר מכן להסיר הפתרון כביסה. חזור על פעמיים. להוסיף 500 µL של פתרון 7:3 MeOH/מים, מערבבים בחושך 1 h ואז להסיר את הפתרוןהתראה: מתנול רעיל על-ידי מגע עם העור או באינהלציה, מיועדת כמו קרצינוגן אנושי. ניצול שלו דורשת מיגון כימי וכפפות. להוסיף 500 µL של ½ MS, מערבבים בחושך למשך 10 דקות ולאחר מכן הסר את הפתרון. חזור על 4 פעמים. 4. הרכבה של דוגמאות על מיקרוסקופ שקופיות מקום 5 טיפות של הרכבה בינונית על משטח זכוכית מיקרוסקופ. בזהירות להפקיד כל HAZ/GALKמתויג חתך בשקופית. למרוח לק על שני צדי המתרס של השקופית. מכסים את השקופית הכוללת coverslip. הקפד להימנע בועות אוויר. להסיר את עודף הרכבה בינונית בעזרת מגבת נייר. חותם את הדגימה עם לק מכל צדדיו 4. תן מסמר לכה יבש בטמפרטורת החדר (כ- 30 דקות). חזור על הצעדים 4.1-4.6 חתכים H/G שליטה שלילי. חזור על הצעדים 4.1-4.6 חתכים שליטה רקע זריחה. לאחסן את השקופיות ב 4 ° C בחושך עד תצפית תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.הערה: ניתן לאחסן שקופיות שהוכנו מראש למשך מספר שבועות עד מספר חודשים בהתאם לאיכות של ההכנה. אם אבחנה חדשה צריכה להיעשות לאחר אחסון, ודא כי הדגימות לא התייבשו. 5. התמונה הרכישה על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה קונפוקלית הפעל את כל היחידות הדרושים של מערכת מיקרוסקופיה קונפוקלית בסדר הנכון על פי הוראות היצרן. בחר את המטרה הרצויה עם מפתח נומרי מקסימלי ומותאמים אורכי גל עירור, פליטה (למשל, obj. 60 x, 1.2 נ. א. ערוץ Autofluorescence: λex 405 ננומטר, λem 450 nm /25; SPAAC HAZ ערוץ: λex 488 ננומטר, λem 525 nm /25; CuAAC GALK ערוץ: λex 561 nm, λem 595 nm /25; מצב רציפים). בחר את הפרמטרים הרצויים עבור הדור של תמונות בתוכנה (12 או 16 סיביות נדרש, גודל הפיקסל המותאמים את קריטריון נייקוויסט). מקם את השקופית HAZ/GALK על הבמה מיקרוסקופ ומקם את הדגימה תחת עדשת המטרה. להתבונן ולמצוא את האזור הרצוי של רקמת הצמח. לרכוש באיכות גבוהה תמונות קונאפוקלית של כפליים תוויות HAZ/G מדגםALK . בחר את המטוס הכי פלורסנט ציר z. כוונן רווח, היסט וכוח לייזר כדי להשיג תפוצה אופטימלי איתות לאורך הטווח ברמת כל אפור לכל ערוץ (autofluorescence, HAZ ו- GALK). יש להחיל באותם הפרמטרים עבור כל הרכישות הבאות. השקת רכישת התמונה שנבחרה ולשמור את הקובץ. חזור על כל אזור הרלוונטיים של המדגם.הערה: שחזורים Z-מחסנית 3D גם ניתן לרכוש במידת הצורך. באמצעות אותן הגדרות, לרכוש תמונות לא מתויגות מדגם הדגירה רק ב MS ½ כדי לקבוע את רמת autofluorescence (קרינה פלואורסצנטית רקע פקד כמתואר בסעיף 2). באמצעות אותן הגדרות, לרכוש תמונות על הדגימות שליטה שלילי מודגרות עם יליד monolignols H/G כדי לקבוע fluorophore שאינם ספציפיים הדבקה על המדגם. החל טיפול נתונים לתמונות רכשה לאותות לחסר רקע autofluorescence H/G שלילי שליטה תמונות והן תמונות HAZ/GALK .

Representative Results

באמצעות פרוטוקול בליס הציג מעורבים תחליפי monolignol סינתטי ו bioorthogonal לחץ על כימיה, ניתן לדמיין את הדינמיקה של תהליך lignification צמחים חיים. בניגוד טכניקות הוקמה ליגנין ויזואליזציה (כגון פתולוגיה מכתים, immunolocalization או autofluorescence), זה “לחיצה כפולה’ פרוטוקול באופן בלעדי מטרות של ליגנין המיוצר de novo במהלך שיתוף מטבולית צעד ומבדיל ליגנין שישנו המדגם עם הדמיה הסלולר ערוץ שלוש פעמים על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי קרינה פלואורסצנטית (איור 3). H AZ-יחידות מזוהים באמצעות עירור, פליטה אורכי הגל של DBCO-יתד4-5/6-carboxyrhodamine 110 זה במיוחד שלוחצים על גבי אזיד פונקציות של שילב HAZ מולקולות במהלך השלב SPAAC (λex 501 nm /λem 526 ננומטר, הערוץ הירוק), ואילו GALK-יחידות מזוהים באופן דומה בכל אורכי הגל האופיינית של המכשיר azidefluor 545 זה במיוחד שלוחצים על התגים incorporated אלקין מסוף של G ALK במהלך השלב CuAAC (λex 546 nm /λem 565 nm, אדום ערוץ); הערוץ השלישי מקביל ליגנין הקיימת מראש, אשר מזוהה באמצעות autofluorescence מהותי שלה ב 405 ננומטר (ערוץ כחול). גישה זו מובילה הדור של מפות תלת-צבעי לוקליזציה של ליגנין בתוך קירות התא הצמח מספק מידע מדויק המרחבי על נוכחות או היעדרות של מכונות lignification פעיל בין רקמות שונות של איבר (איור 3A ), בין סוגי תאים שונים בתוך הרקמה זהה (איור 3B-C) ובתוך שכבות קיר שונה באותו התא (דמות תלת-ממד). במילים אחרות, מתודולוגיה זו מאפשרת לנו להאיר, במיוחד בתרגום האתרים lignification ‘פעיל’ (HAZ ו- GALK ערוצים) מאת המבדילים אותם מאזורי איפה ליגנין הוקמה ב שחרור מוקדם שלבי התפתחות הצמח (ערוץ autofluorescence). בנוסף, הרגישות של הטכניקה באופן דרמטי מוגברת בהשוואה autofluorescence, כמויות הרבה יותר קטן של ליגנין טרי מסונתז וניתן זוהה (איור 3B). איור 3: הדמיה של כתבות כימי. incorporated monolignol עם גבעולי פשתן. (א) מחצית קטע ואלכסוני בעבודת יד של גזע פשתן, תמונה המשוחזרת. צילום מקרוב של השכבות הראשונות להבדיל עצה (B). עזב לוח: ליגנין autofluorescence (כחול, 405 ננומטר), בחלונית האמצעית: התמזגה ליגנין autofluorescence (כחול) ו- HAZ קרינה פלואורסצנטית (ירוק, 526 ננומטר) ערוצי, לוח נכון: התמזגה ליגנין autofluorescence (כחול) ו- GALK קרינה פלואורסצנטית (565 אדום, nm) ערוצים. החץ מצביע על קיר התא שכותרתו הראשון מ cambium הממחישות את רגישות מוגברת של אושר בהשוואה autofluorescence. (ג) Labeling בתא שונים סוגי עצה משנית (D) מקרוב על עצה משני תאים הממחישות את הווריאציות תיוג ברבדים שונים של דופן התא אותו. עזב לוח: התמזגה ליגנין autofluorescence (כחול) ו- HAZ קרינה פלואורסצנטית (526 ירוק, nm) ערוצי, בחלונית האמצעית: התמזגה ליגנין autofluorescence (כחול) ו- GALK קרינה פלואורסצנטית (565 אדום, nm) ערוצי, ימין לוח: התמזגה ליגנין autofluorescence (כחול), HAZ (ירוק) וערוצי פלורסצנטיות GALK (אדום). לוקליזציה שיתוף HAZ ו- GALK מתואר בצהוב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. כתב כימי אסטרטגיות כגון שיטת באושר המובאים כאן או ההליכים תיוג בודד שפורסמו קודם לכן על ידי. Tobimatsu et al. 8 ולכן מאפשר מחקר עדינה יותר הרבה יותר נגישים בעבר שיטות כגון חיסונית – או פתולוגיה מכתים בעת היותו פשוט מאוד ליישם. למשל, איור 4 ממחישה את עוצמת האות עבור HAZ/GALK תיאגוד סיבים tracheids/כלי (FT) עצה משנית פשתן הוא גבוה מאוד בתוך הקירות התא הראשון כמה מן cambium אבל בהדרגה מקטין ב תאים בוגרים. פרופיל זה היא הפוכה מזו של autofluorescence ומציין שאת lignification המרבי מתמלאת במהירות רבה הרבדים תא 2-3 מטרים הראשון מ cambium. לעומת זאת, תאים ריי (R) מופיעים כדי להמשיך lignification על הרבה בשלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות שלהם כמו HAZ/GALK ההתאגדות היא הרבה יותר מתמיד בקירות של כל התאים מפני cambium הפקק. . זה לא מפתיע כי סוגי תאים מטרים ו- R להציג lignification בניגוד דינמיקה, כיוון מסוגי התאים בעלי תפקידים ביולוגיים שונים עם הבדלים המשויכת בתוכנית ההתפתחותי שלהם. FTs הינם צינורות מאורכים אכן מבוגרים ולא למות במהירות, תאים ריקים מת עוזב עם קירות עבים מעוצה זו ממלאים תפקידים חיוניים תמיכה מכנית והן תעבורה אנכי של מים ומינרלים, ואילו השורות הצר של R תאים זה להלחין את עצה קרני הם בחיים במצבם בוגרת ופונקציונליים מבלי קירות עבים מעוצה. איור 4: ספציפי תא monolignol כתב ההתאגדות בשנת עצה פשתן. ברייט-שדה מיקרוסקופיה קונפוקלית נוף (A) של חלק חתך ביד חופשית של גבעול פשתן. ורוד (ריי parenchyma תאים, R) וצהוב (סיבים tracheid תאים, מטרים) חיצים מציינים את המומנט פורש מאזור cambial לעבר הפקק, תיסרק עבור ליגנין autofluorescence-405 ננומטר (B), קרינה פלואורסצנטית HAZ -526 nm (ג) ו- G ALK זריחה-565 nm (D). (E) מבט עצה משנית. השאיר פאנל: התמזגה ליגנין autofluorescence (כחול), HAZ (ירוק), ו- GALK פלואורסצנטי (אדום) ערוצים. לוקליזציה שיתוף HAZ ו- GALK מתואר בצהוב. לוח נכון: איור סכמטי של המבנה עצה משנית בגזע פשתן. V, כלי השיט; מטרים, tracheid סיבים; R, ריי parenchyma התא. דמות זו שונתה מ. אריה ואח 23 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. בנוסף, השימוש של שני הכתבים כימיים ברורים המתאימים כדי H-G-יחידות עם שתי תגובות bioorthogonal בפרוטוקול בליס מאפשר תוצאות כמותיות יותר ואפשר להשיג. מרובב תיוג אסטרטגיות כגון בליס יכולה לספק תובנות נוספות על השליטה של monolignol יחסי התאגדות בתנאים שונים יכול לתרום פענח את התהליך lignification חמקמק. אם האחוזים היחסיים של monolignols H, G ו- S ב- lignins הם אכן משתנה מאוד בהתאם מינים, רקמות, גיל או תנאים סביבתיים של הצמח, המנגנון הסבוך המסדירים ההרכב הזה עדיין לא לגמרי מובנים. הטכנולוגיה תיוג כפול מייצג דרך רבת עוצמה של חוקרים חלק מהפרמטרים המסדירים ההרכב ליגנין. לדוגמה, משתנה את HAZ: GALK יחס עם האושר אפשרה לנו להפגין כי הרכב ליגנין ברקמות עצה משנית היא תלויה ישירות monolignol זמינות בתוך קירות התא, ולא על ירידה לפרטים peroxidase/laccase (איור 5). איור 5: השפעת המקננת קטעים גזע פשתן עם יחס שונה באחוזים של HAZ ו- GALK. HAZ: GALK% היחס ניתנת מעל כל עמודה של דמויות. העליון: התמזגה HAZ וערוצי GALK . למטה: היסטוגרמות המציין פלורסצנטיות ממוצע עוצמת HAZ ו- GALK עבור יחס שונה %. ערכים מבוטא ממוצע של עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע ב רמות האפור ± SD. סולם בר = 100 מיקרומטר. דמות זו שונתה מ אריה ואח 23 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. פשתן הוא גדל על באסט הסיבים שלה (BF) המשמשים לייצור בדים, ניירות יוקרה או חומרים מרוכבים ידידותיים לסביבה. היבט חשוב של valorization תעשייתי שלהם היא שהם מכילים רמות נמוכות מאוד של ליגנין בקירות התא שלהם, אשר מאופיינים על ידי עבות במיוחד S2/G שכבה משני19,24. האושר ניתן לסמן lignification dynamics ההבדלים בין הרבדים השונים של דופן התא אותו. איור 6A מראה התאגדות כתב HAZ ו- GALK מוגבלים תא ופינות, דופן התא (middle lamella) / ראשי של סיבי באסט כמה אך לא כולם. העדר מוחלט של lignification בשכבה עבה באסט סיבים משני תאים קיר גם כאשר הכתבים כימיים monolignol, exogenously סיפק מגלה כי מדינתם hypolignified נובע היעדר סביבה מולקולרית מתאים בתיווך enzymatically חמצון תיאגוד monolignols לתוך שרשרת הפולימר גדל, שזה לא רק בשל רגולציה תעתיק של גנים ביוסינטזה monolignol כאמור דיווחו25. התבוננות זו גם להרכב גם העובדה הזאת peroxidase פשתן הגנים למעלה-מוסדרים ברקמות גזע החיצוני של המוטציה כימי פשתן lbf1 בעלת סיבים באסט מעוצה26. איור 6: אושר מדגיש הבדלים ספציפיים התחתי או שכבות דופן התא. החלונית השמאלית (A): בהיר-שדה תמונה של מקטע גזע פשתן. העיגול מציינת צרור סיבי. לוח נכון: תקריב על סיבי באסט. התמזגה HAZ וערוצי GALK (עם ובלי בהיר-שדה) מציג את lignification מוגבלת תא ופינות (), דופן התא (middle lamella) / ראשי של כמה סיבי באסט. BF, באסט סיבים; נקוב, parenchyma תא; M, (middle lamella); P, קיר התא הראשי; S1, השכבה הראשונה של דופן התא משני; שכבה S2/G, משני שכבה/ג’לי של דופן התא משני. פרוסה 2D (B), שחזור תלת-ממד של זום קונאפוקלית z-מחסנית של אזור endodermis שורש פשתן. רצועת Casparian () רק מציג autofluorescence ולשלב לא HAZ או GALK. Fluorogram המשויך מראה של GALK/HAZ המתאם אנטי: זריחה ירוק גבוהה קשורה אות אדומה נמוכה (cortex) ולהיפך (endodermis). Pericycle (P), Endodermis (ה), Cortex (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. בסופו של דבר, מתודולוגיה זו שני צבעים יכולים גם לספק מידע רב ערך על ‘המדינה lignification’ של דופן התא substructures בשלבים התפתחותיים שונים, באיברים צמח שאינו הגבעול. לדוגמה, endodermis של פשתן שורשים מאופיין על ידי קיומה של להקה Casparian חומותיה תא רדיאלי, רוחבי כבר בשלבים המוקדמים של פיתוח. הלהקה של ביופולימרים הידרופוביות, העשוי suberin ו/או ליגנין, מונע מים מומסים בגבול נלקח על ידי שורש מלהיכנס פסיבי דרך אפופלסט ומאלץ אותם לעבור דרך קרום פלזמה דרך מסלול symplastic ובכך לתרום תפיסה סלקטיבית הקיבולות של שורשי צמחים. כאשר מוחל על השורשים פשתן, האסטרטגיה שלנו הראה כי HAZ ו- GALK משולבים בתוך הקירות וקולו של תאים endodermal באותה מידה כמו חלקי הקירות רדיאלי איפה הלהקה Casparian נעדר (איור 6B). עם זאת, העדר מוחלט של התאגדות כתב monolignol בלהקה Casparian עצמו מציין כי הוא בוגר בשלב התפתחותי זה בעוד שאר קירות הם עדיין אתר נוסף ביופולימרים התצהיר. התצוגה 3D המשוחזרת של z-מחסנית מביא בבירור את הלהקה Casparian אור. מעניין, הקירות של כמה תאים בקליפת המוח בצמוד endodermis גם הוכיח יכולת של שילוב HAZ מעדיפים (ובכך המציין את הנוכחות של ליגנין/suberin בקליפת השורש פשתן) אבל לא GALK. ניתוח לוקאליזציה שיתוף הראה אנטי-ומאופיינת HAZ ו- GALK, אשר מציע את קיומו של מכונות מבנה/אנזימטי ספציפי תא קיר באלה שני סוגי תאים סמוכים. משלימה טבלה 1: הכנת מוצק בינוני ½ MS אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ. משלימה בטבלה 2: ההכנה של פתרונות מניות כתב כימיים אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Discussion

כאמור, הפרוטוקול אושר כפול תיוג שהוצגו במאמר זה היא אחת הדוגמאות הראשונות SPAAC/CuAAC שילוב ויוו¹²^,²³. כל שלב היה ביסודיות ממוטב לאמת ואני זה מאוד חשוב כי הסדר שבו השניים לחץ על כימיה תיוג תגובות ברצף מבוצעות מכובד (קרי, SPAAC, ואחריו CuAAC). הצלב כל-הפקדים הראה כי כל שלב תיוג היא ספציפית כאשר הפרוטוקול אושר יישומית²³ : ביצוע השלב SPAAC הראשון מוביל chemoselective מאוד תיוג של H_AZ אזיד פונקציות על-ידי cyclooctyne functionalized fluorophore דרך תגובה [3 + 2] cycloaddition עם קינטיקה מהר. ברגע יחידות H_AZ מתויגים, השלב CuAAC המחייב הפעלה copper(I) מזורז של G_ALK alkynes מסוף כדי ליצור קישורים triazole על ידי תגובה עם החללית 545 אזיד-עבור חיל הים יכול להתבצע. לעומת זאת, הסדר ההפוך (קרי, CuAAC, ואחריו SPAAC) לא אמור לשמש כמו זה מוביל ליחידה G_ALK ו- H_AZ קרוס-מצמד, אשר מתחרה עם fluorophore מצדו ומשרה ההפסד הדרמטי של האות . חשוב גם להדגיש את נחיצות השלבים כביסה ביניים כדי למנוע כתמים שאינם ספציפיים.

אנחנו הראו כי השיטה שלנו ניתן להחיל עיצובים ניסוי ביולוגיים שונים. האושר תיוג פרוטוקול הוחל לראשונה על חתכים ביד חופשית של גבעולים זרעי פשתן (כ 150-250 מיקרומטר עבה) היו בעבר לחתוך, מודגרות עם monolignols מוכן-לחץ. למרות העיצוב הזה יש את היתרון של צמצום הכמויות הדרושות של הכתב כימי (כפי הדגירה כרכים מופחתים) ושל הקלת ייצור ושכפול סטטיסטית, זה לא, אם אתה קפדן, מערכת ויוו מסוימים המקרים, אינן משקפות בהכרח בכל ההיבטים של דינמיקה lignification אמיתי-עתיים. בתכנון הניסוי השני, לכן התאמנו הפרוטוקול אושר שיטה שבה השתמשת קודם לכן כדי ללמוד שילוב של monolignols radiolabeled אורן, גינקו²⁷. בגישה זו, השורשים ואת גזע של הצמח מופרדים פיזית, הבסיס של כל גזע מודגרת בפתרון monolignol ב מה עשוי להיות שכונה הגישה “אגרטל פרחים”. לאחר שעזב את הגבעולים זמן הרצוי (הדגירה), חתכים הם גזור את הפרוטוקול אושר לבצע. זו אפשרה לנו להראות (i) כי monolignols ששונה מועברים דרך הגבעול חי, משולבים גדל ליגנין פולימרים בתוך קירות התא ואת (ii) כי התבנית לוקליזציה היה בעיקרו של דבר זהה לזו של חתך הרוחב הגישה. זה סוג של ניסוי יש בצורך מבוצע ב צמח חי ואמיתי / תא חי לגשת ומאפשר יותר ניסויים ומחקרים מעמיקים יותר, אך דורשת כמויות יותר כתב כימי. לבסוף, הפרוטוקול אושר שימש גם עם שתילים מפעל פשתן, ייצוג אמיתי חי צמח מודל שבו העיתונאים כימי כנראה נספג דרך השורשים לפני מובלים את הגבעול. בעוד מודל זה יש יתרון ברור של מבוצע ב צמחים חיים, בפועל, זה מוגבל השתילים והוא לא מתאים באמת חוקרים lignification dynamics צמחים בוגרים מסיבות מעשיות (זמן דגירה ארוך, מוגבה כמות של עיתונאים כימי). ובכל זאת, עיצובים ניסוי שלושת אלה הם משלימים, ובכולם יש היתרונות והחסרונות שלהם לגבי ההיבטים המעשיים ומשמעויות ביולוגי בהתאם לסוג השאלה ביולוגי שנענתה.

שפותחה כדי ללמוד את הדינמיקה lignification של פשתן, פרוטוקול שלנו היא מאוד, לא רק מבחינת עיצוב הניסוי הביולוגי, אלא גם מבחינת היישום שלה לשני צמח מינים ורקמות/איברים. למשל, האושר ניתן בקלות להעביר את תודרנית או סוגים של צפצפה נתונות יותר מחקרים עם מוטציות מעלף או דפיקה למטה עבור גנים שונים. בעקרון, מחקרים תיוג כפול עם הגישה שלנו גם ניתן להרחיב את מולקולות אחרות באמצעות שני מבשרי ששונה ברורים של הצמח דופן התא פולימרים – כולל כל שלוש monolignols הראשי או סימנים מקדימים חילוף החומרים שלהם גם כן שונים כמו monosaccharides המהווים המטריקס רב-סוכר. מאז הקמתה, כימיה bioorthogonal אכן בעיקר פותחה כדי לחקור glycans/פוליסכרידים-פחמימה # מיון הפחמימות מטבולית הנדסה (מו)⁴^,⁵^,¹⁷^,²⁸, אבל באופן מפתיע היו רק מעט מאוד יישומי לשתול ביולוגיה כה⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². מבחינת תאימות של התגובות, המחקר של ליגנין אכן היה תיק מורכב לפתור כמו שני כתבים כימי משולבים באותה רשת לסופרמרקטים הפולימר. האפשרות של Hללא תווית_AZ–G_ALK קישור היווצרות היה ההיבט להתגבר בשל הקרבה המרחבי של G_ALK ויחידות_AZ Hבתוך 3D מבנה של ליגנין²³, מגבלה זה עשויים שלא להופיע אם הכתבים כימי שני אינם כלולים באותו סוג של ביופולימרים או באותו אזור המרחבי של תא נתון כלשהו.

בהיקף רחב יותר המתודולוגיה בליס יכול בעצם להיות מיושם בכל מחקר הדמיה של שני צבעים פלורסצנטיות במודלים חיידקי או בעלי חיים באמצעות שני הכתבים כימיים ברורים הנושאת אזיד תג ותג מסוף אלקין, בהתאמה.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנחנו חבים את FRABio הפדרציה מחקר ולמערכת הדמיה TisBio (אונ’ Lille, CNRS, FR 3688, FRABio, BiochimieStructurale et במכלולים des Fonctionnelle Biomoléculaires) למתן הסביבה טכני להצטיינות להשיג את זה עבודה.

Materials

(E)-4-(3-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)prop-1-en-1-yl)phenol (H_AZ)			Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338
(E)-4-hydroxy-3-propargyloxycinnamyl alcohol (G_ALK)			Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338
2% sodium hypochlorite
20 cm high glass tube
250 mL Schott glass bottle
48-well Plate
5/6-TAMRA-PEG₃-Azide	Jena Bioscience	CLK-AZ109-1
Aluminium foil
Cheese cloth
Compost containing clay
Coniferyl alcohol (G)	Sigma Aldrich	MFCD00002922
Copper (II) sulfate pentahydrate
DBCO-PEG₄-5/6-Carboxyrhodamine 110	Jena Bioscience	CLK-A127-1
Milli-Q Ultrapure water
Eppendorf 1,5 mL
EtOH
Flax seeds (L. usitatissimum L.)
Fluoromount-G™ Slide Mounting Medium	Electron Microscopy Sciences	17984-25
Glass coverslip
Glass microscope slide
Growth chamber	CLF-Plant Climatics		For 2-week-old plants culture
Growth chamber	Angelantoni Life Sciences		For 2-month-old plants culture
Magenta plant culture box			For 2-week-old seedling culture
Methanol			Toxic (SGH02, SGH06, SGH08), work with gloves under a hood
Micropipette
Nail polish
Nikon A1R confocal microscope	Nikon
Orbital shaker
Parafilm
p-Coumaryl alcohol (H)	Carbosynth	FC145653
Plastic cap
Plastic pipette
Plastic pot			For 2-month-old plants culture
Razor blade
Rubber band
Sodium Ascorbate
Sterile clamp
Vertical support
Vortex
Reagents for liquid and solid ½ MS medium
KH₂PO₄
KNO₃
NH₄NO₃
MgSO₄.7H₂O
CaCl₂.2H₂O
MnSO₄.H₂O
ZnSO₄.7H₂O
H₃BO₃
KI
Na₂MoO₄.2H₂O
CuSO₄.5H₂O
CoCl₂.6H₂O
Na₂EDTA.2H₂O
FeSO₄.7H₂O
Thiamine.HCl
Pyridoxine.HCl
Glycine
Nicotinic acid
Myo-inositol
Saccharose
MES hydrate
Agar

References

Grammel, M., Hang, H. C. Chemical reporters for biological discovery. Nat Chem Biol. 9 (8), 475-484 (2013).
Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. Chemistry in living systems. Nat Chem Biol. 1 (1), 13-21 (2005).
Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal chemistry: fishing for selectivity in a sea of functionality. Ange Chemie (Int Ed. Engl). 48 (38), 6974-6998 (2009).
Chang, P. V., et al. Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars. Ange Chemie (Int Ed. Engl). 48 (22), 4030-4033 (2009).
Gilormini, P. A., et al. A sequential bioorthogonal dual strategy: ManNAl and SiaNAl as distinct tools to unravel sialic acid metabolic pathways. Chem. Commun. 52 (11), 2318-2321 (2016).
Mbua, N. E., et al. Abnormal accumulation and recycling of glycoproteins visualized in Niemann-Pick type C cells using the chemical reporter strategy. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (25), 10207-10212 (2013).
Anderson, C. T., Wallace, I. S., Somerville, C. R. Metabolic click-labeling with a fucose analog reveals pectin delivery, architecture, and dynamics in Arabidopsis cell walls. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1329-1334 (2012).
Tobimatsu, Y., et al. A click chemistry strategy for visualization of plant cell wall lignification. Chem. Commun. 50 (82), 12262-12265 (2014).
Bukowski, N., et al. Development of a clickable designer monolignol for interrogation of lignification in plant cell walls. Bioconjugate Chem. 25 (12), 2189-2196 (2014).
Pandey, J. L., et al. A versatile click-compatible monolignol probe to study lignin deposition in plant cell walls. PLOS ONE. 10 (4), e0121334 (2015).
Pandey, J. L., et al. Investigating biochemical and developmental dependencies of lignification with a click-compatible monolignol analog in Arabidopsis thaliana stems. Front Plant Sci. 7, (2016).
Zhu, Y., Wu, J., Chen, X. Metabolic labeling and imaging of N-linked glycans in Arabidopsis thaliana. Ange Chemie (Int Ed. Engl). 55 (32), 9301-9305 (2016).
Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. Lignin biosynthesis. Annu Rev Plant Biol. 54, 519-546 (2003).
Weng, J. -. K., Chapple, C. The origin and evolution of lignin biosynthesis. New Phytol. 187 (2), 273-285 (2010).
Mottiar, Y., Vanholme, R., Boerjan, W., Ralph, J., Mansfield, S. D. Designer lignins: harnessing the plasticity of lignification. Curr Opin Biotechnol. 37, 190-200 (2016).
Rinaldi, R., et al. Paving the way for lignin valorisation: recent advances in bioengineering, biorefining and catalysis. Ange Chemie (Int Ed). 55 (29), 8164-8215 (2016).
Wratil, P. R., Horstkorte, R., Reutter, W. Metabolic glycoengineering with N-acyl side chain modified mannosamines. Ange Chemie (Int Ed. Engl). 55 (33), 9482-9512 (2016).
Feng, L., et al. Bifunctional unnatural sialic acids for dual metabolic labeling of cell-surface sialylated glycans. J Am Chem Soc. 135 (25), 9244-9247 (2013).
Dumont, M., et al. Plant cell wall imaging by metabolic click-mediated labelling of rhamnogalacturonan II using azido 3-deoxy- d – manno -oct-2-ulosonic acid. Plant J. 85 (3), 437-447 (2016).
Niederwieser, A., et al. Two-color glycan labeling of live cells by a combination of Diels-Alder and click chemistry. Ange Chemie Int Ed. 52 (15), 4265-4268 (2013).
Späte, A. -. K., et al. Exploring the potential of norbornene-modified mannosamine derivatives for metabolic glycoengineering. Chem Bio Chem. 17 (14), 1374-1383 (2016).
Späte, A. -. K., et al. Rapid Labeling of metabolically engineered cell-surface glycoconjugates with a carbamate-linked cyclopropene reporter. Bioconjugate Chem. 25 (1), 147-154 (2014).
Lion, C., et al. BLISS: a bioorthogonal dual-labeling strategy to unravel lignification dynamics in plants. Cell Chem Biol. 24 (3), 326-338 (2017).
del Río, J. C., et al. Structural characterization of guaiacyl-rich lignins in flax (Linum usitatissimum) fibers and shives. J Agric Food Chemist. 59 (20), 11088-11099 (2011).
Huis, R., et al. Natural hypolignification is associated with extensive oligolignol accumulation in flax stems. Plant Physiol. 158 (4), 1893-1915 (2012).
Chantreau, M., et al. Ectopic lignification in the flax lignified bast fiber1 mutant stem is associated with tissue-specific modifications in gene expression and cell wall composition. The Plant Cell. 26 (11), 4462-4482 (2014).
Terashima, N., Ko, C., Matsushita, Y., Westermark, U. Monolignol glucosides as intermediate compounds in lignin biosynthesis. Revisiting the cell wall lignification and new 13C-tracer experiments with Ginkgo biloba and Magnolia liliiflora. Holzforschung. 70 (9), 801-810 (2016).
Noel, M., et al. Probing the CMP-sialic acid donor specificity of two human β-d-galactoside sialyltransferases (ST3Gal I and ST6Gal I) selectively acting on O- and N-glycosylproteins. Chembiochem: Eur J Chem Biol. , (2017).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citer Cet Article

Simon, C., Spriet, C., Hawkins, S., Lion, C. Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS!. J. Vis. Exp. (131), e56947, doi:10.3791/56947 (2018).