JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurosciences

Ratiometric Calcium beeldvorming van individuele neuronen in gedragen Caenorhabditis Elegans

Published: February 07, 2018
doi:
10.3791/56911
, , , , ,
1Neuroscience Program,University of Miami School of Medicine, 2Department of Biology,University of Miami

Summary

Dit protocol beschrijft het gebruik van genetisch gecodeerde Ca2 + verslaggevers om recordwijzigingen in neurale activiteit in gedragen Caenorhabditis elegans wormen.

Abstract

Het steeds duidelijker dat de neurale activiteit in het gedrag van de dieren aanzienlijk van die in narcose of geïmmobiliseerdet dieren gezien verschilt geworden. Zeer gevoelige, genetisch gecodeerde fluorescerende verslaggevers van Ca2 + hebben een revolutie teweeggebracht in de opname van cel en synaptische activiteit met behulp van niet-invasieve optische benaderingen in gedragend dieren. Combinatie met genetische en optogenetic technieken, de moleculaire mechanismen die cel en circuit activiteit modulate tijdens verschillende gedrag Staten kunnen worden geïdentificeerd.

Hier beschrijven we methoden voor ratiometric Ca2 + beeldvorming van interne neuronen in vrij gedragen Caenorhabditis elegans wormen. We laten zien een eenvoudige montage techniek die zachtjes overlays wormen groeien op een standaard Nematode groei Media (NGM) agar blokkeren met een dekglaasje aan glas, dieren worden geregistreerd op het toelaat met een hoge resolutie tijdens onbeperkt verkeer en gedrag. Met deze techniek, we gebruiken de gevoelige Ca2 + verslaggever GCaMP5 om veranderingen in intracellulaire Ca2 + in de serotonerge hermafrodiet specifieke neuronen (HSNs) als ze ei leggen van gedrag rijden. Door mede uiting van mCherry, een Ca2 +-ongevoelig fluorescent proteïne, kunt wij de positie van de HSN binnen ~ 1 µm en correcte voor schommelingen in de fluorescentie veroorzaakt door veranderingen in focus of beweging. Gelijktijdige, infrarood helderveld imaging zorgt voor gedrag opname en dierlijke bijhouden van het gebruik van een gemotoriseerde stadium. Door de integratie van deze microscopische technieken en gegevensstromen, kunt wij Ca2 + activiteit opnemen in het circuit C. elegans ei-leggen als het meer dan tientallen minuten tussen inactief en actief gedrag staten vordert.

Introduction

Een centrale doelstelling van de neurowetenschappen is te begrijpen hoe de neuronen communiceren in schakelingen naar station dierlijk gedrag. Neurale circuits integreren een scala van uiteenlopende sensorische signalen om te veranderen van circuit activiteit, waardoor gedragsveranderingen nodig zijn voor de dieren om te reageren op hun omgeving. De nematode, C. elegans, heeft een eenvoudige nervous system met een 302 neuronen waarvan synaptic verbindingen volledig toegewezen1 zijn. Genen die voor eiwitten die betrokken zijn in de transmissie coderen zijn bovendien zeer bewaard tussen C. elegans en zoogdieren2. Ondanks de anatomische eenvoud van haar zenuwstelsel toont het een complexe repertoire van geconserveerde gedrag bieden een vruchtbare platform om te begrijpen hoe de neuronen reguleren gedrag3.

C. elegans is vatbaar voor de toepassing van een breed scala van benaderingen zoals genetische manipulatie, laser cel ablatie, elektrofysiologische technieken, evenals in vivo optische beeldvorming4,5. Recente studies hebben gedetailleerde kaarten van de belangrijke neurotransmitter signalering systemen in C. elegans met inbegrip van de cholinerge en GABAergic neuronale netwerken. Deze studies, samen met lopende studies om de uitdrukking van alle neuronale G-eiwit gekoppelde receptoren in kaart plaatst dit model in een unieke positie om de invloed van zeer gedetailleerde structurele en functionele neuronal connectiviteit kaarten om volledig te begrijpen hoe deze verschillende neurotransmitters signaal door verschillende receptoren en tijdschalen station verschillende aspecten van dierlijk gedrag.

Om dynamische Neuronale activiteit patronen te bestuderen in elk systeem, is een essentiële voorwaarde het ontwikkelen van robuuste methoden om vast te leggen van activiteit in individuele neuronen of hele schakelingen tijdens gedrag. Vooral belangrijk is de inschikkelijkheid van dergelijke optische benaderingen voor het visualiseren van de presynaptische activiteit die synaptic vesikel fusion drijft. Snel en uiterst gevoelige fluorescerende verslaggevers van intracellulaire Ca2 +, samen met de toenemende beschikbaarheid van gevoelige fotodetectoren, hebben een revolutie teweeggebracht in de opname van cel en synaptische activiteit in wakker, levende dieren tijdens gedrag. Omdat een belangrijke uitkomst van synaptic elektrische activiteit is het reguleren van Ca2 + kanalen, worden veranderingen in intracellulaire Ca2 + verondersteld om getrouw verslag gedragsgestoorde relevante veranderingen in activiteit van de cel.

In deze studie presenteren we een aanpak voor het uitvoeren van ratiometric Ca2 + beeldvorming in de serotonerge HSN motorische neuronen die ei leggen van gedrag in C. elegans6,7 bevorderen. Deze benadering bouwt voort op eerdere pogingen om te visualiseren van Ca2 + activiteit in C. elegans en het leggen van eieren circuit tijdens gedrag5,8,9,10,11 . De methode kunt gelijktijdig correleren de waargenomen wijzigingen in cel/circuit activiteit met ei-leggen gebeurtenissen, evenals wijzigingen in dierlijke locomotor staat. Hoewel wij deze benadering gebruiken voor de analyse van de activiteit in volwassen wormen, toont onuitgegeven werk van onze laboratorium dat deze aanpak kan worden uitgebreid tot jonge dieren op de vierde larvale (L4) stadium zo goed. Het is waarschijnlijk dat de activiteit van andere C. elegans neuronen die in verschillende circuits en gedrag functioneren ook toegankelijk zijn met deze techniek moet. Andere onlangs snel Ca2 + indicatoren ontwikkeld met niet-overlappende emissie spectra12,13,14,15,16, optogenetic tools17 , en genetisch optische indicatoren van membraan spanning18gecodeerd, moet laten uitvoeren doordringende ‘all-optische’ onderzoeken hoe veranderingen in de neurale activiteit verschillend gedrag Staten drijven.

Protocol

1. stammen, cultuur, Media, en de montage van dieren C. elegans wormen bij 20 ° C op standaard 60 mm Nematode groei Medium (NGM) agar platen met OP50 E. coli bacteriële voedsel19agarvoedingsbodem groeien. Twee plasmiden voorbereiden op elke cel-specifieke promotor van belang: een uitdrukking van GCaMP5 naar record intracellulaire Ca2 +, en de tweede, uitdrukking van mCherry met het oog ratiometric kwantificatie van GCaMP5 fluorescentie wijzigingen rijden rijden en object zoeken en meting te vereenvoudigen.Opmerking: GCaMP5:mCherry ratiometric imaging corrigeert voor schommelingen in de GCaMP5 fluorescentie die uit veranderingen in focus en dier verkeer, niet de werkelijke veranderingen in intracellulaire Ca2 voortvloeien +. GCaMP5 – en mCherry-uiting van plasmiden samen met de pL15EK zichtbaar redding marker plasmide injecteren de geslachtsklieren van LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X mutant dieren en herstellen van niet-Muv lin-15(+) dieren uiting van GCaMP5 en mCherry van een hoge-kopie transgenic20,21,22. De lite-1 mutant achtergrond gebruiken om blauw-licht vermijden gedrag23,24. Integreren van transgenen aan chromosomen mozaïcisme verminderen en vereenvoudigen van de generatie van samengestelde gemuteerde stammen25.Opmerking: De hier beschreven LX2004-stam draagt een geïntegreerde hoge-kopie transgenic die, GCaMP5 en mCherry in de HSNs van de promotor van de nlp-3 uitdrukt (Zie Tabel van materialen)26,27, 28 , 29. de promotor van de nlp-3 bleek te rijden sterke expressie in de HSNs van wijlen L4 en volwassen dieren zonder (e.g.,tph-1, waardoor aanzienlijke gebreken in HSN ontwikkeling of ei-leggen gedrag ten opzichte van andere initiatiefnemers getest EGL-6, en unc-86). Deze spanning en anderen die uitdrukking geven aan GCaMP5 en mCherry in de ventrale snoer (VC) motorische neuronen, vulval spieren en uv1 neuro-endocriene cellen zijn verkrijgbaar bij de Caenorhabditis genetica Center en details van hun constructie zijn beschreven 27. OP50 bacteriële levensmiddelen uit een geplaatste NGM agarplaat naar de onderkant van een platina worm Kies toepassen en gebruiken het om te zetten ~ 20 laat L4 LX2004 dieren die uitdrukking geven aan GCaMP5 en mCherry in de HSNs van de promotor van de nlp-3 . Ervoor zorgen dat de ontwikkelingslanden vulva in een stereomicroscoop wordt weergegeven als een duidelijke donkere vlek omgeven door een witte halve maan. Incubeer dieren bij 20 ° C gedurende 24-40 uur. Na de incubatie, OP50 van toepassing op de pick en overdracht ~ 3 van de wormen aan een unseeded NGM plaat, waardoor een kleine hoeveelheid voedsel achter voor de wormen te voeden op tijdens imaging. Zorgen voor voldoende voedsel, te weinig bacteriële voedsel zal aanmoedigen de wormen te dwalen weg van het midden van de plaat, terwijl te veel voedsel zullen achtergrond fluorescentie verhogen en hypoxie veroorzaken. Gebruik een plat afgeronde spatel te snijden een ~ 20 x 20 mm stuk van de plaat met de wormen en de overdracht van de Brok zijde naar beneden in het midden van een schone 24 x 60 mm #1.5 dekglaasje aan (Figuur 1). Start de toepassing van de ene kant om te voorkomen dat bubbels wordt gevangen onder het dekglaasje aan en bemoeizuchtige met beeldvorming. Breng een dekglaasje 22 x 22 mm #1 aan tot de bovenkant van het blok steken en verdamping te verminderen. 2. hardware en instrumentatie Setup Plaats de gefaseerde, transgene wormen op het podium van een omgekeerde Microscoop met een ≥ 0.7 numerieke diafragma Plan-Apochromat 20 x objectieve gemotoriseerde XY etappe controleerbaar met een joystick, een afbeelding splitter en fluorescentie filters voor gelijktijdige GCaMP5 en excitatie van de mCherry en emissie, camera’s voor fluorescentie en infrarood helderveld imaging, en een triggerable Light Emitting Diode (LED) verlichting systeem(Figuur 2).Opmerking: Een 80/20 beam-splitter verstuurt 80% van het beeld signaal naar de fluorescentie-camera en 20% naar de helderveld camera. Een rechtop Microscoop kan ook worden gebruikt, maar de NGM stuk moet worden geplaatst tussen een glasplaatje en de grote dekglaasje aan in dit geval. Gebruik de verrekijker oculairs te selecteren van een worm voor imaging. Wanneer een dier is geselecteerd, schuif de infrarood filter op zijn plaats boven de condensor. Transistor-transistor-logic (TTL)-triggers Coaxiale kabels uit elk van de drie TTL trigger output lijnen op de fluorescentie camera toevoegen. Het eerste resultaat verbinden met de BNC-ingang #3 van de LED verlichting systeem. De tweede uitgang naar een BNC ‘banaan’ adapter met groene en bruine draden van de 8-pins GPIO connector loopt tot GPIO input #3 (pin 4) en grond (pin 5) van de infrarood camera, respectievelijk. De derde uitgang verbinden met een BNC ‘banaan’ adapter met jumper draden lopen op de digitale ingang van #8 en grond in de overname van de digitale apparaat (Figuur 2B). Overname van de digitale apparaat (DAQ) Sluit de DAQ microcontroller board (Zie Tabel van materialen) aan op de PC via een USB-kabel. Updaten van de firmware met de standaard Firmata protocol (Zie Tabel van materialen) en configureren van de USB-poort om te communiceren op 57600 baud. LED ‘s Deze LED Controller-software worden uitgevoerd (Zie Tabel van materialen). De Trigger-modus van ‘Continu aan ‘Gated’ en selecteer Trigger kanaal ‘ 3’ voor zowel de 470 en 590 nm-LEDs schakelen Zet en LED power Voer voor elke LED (bijvoorbeeld set de 470 nm LED tot 20% en de 590 nm LED tot 40%). Voer de seriële-stage communicatie script ‘XY-fase-finale’ in Bonsai (Zie Tabel van materialen)30. Klik op de grijze ‘CsvWriter’-knooppunt en selecteert u een map op te slaan de opgenomen X en Y etappe informatie (Figuur 3). Druk op de groene pijl in de werkbalk voor het initialiseren van de DAQ.Opmerking: Het script zal beginnen te registreren van de X en Y fase positie wanneer de fluorescentie camera een TTL-signaal stuurt. Dit script uitgangen vier kolommen met gegevens: frame nummer, X-positie (µm), Y-positie (µm) en het interval tussen frames (s). In de infrarood camera opname software (Zie Tabel van materialen) onder ‘Aangepaste Video Modes,’ selecteren ‘Modus 1’ (2 x 2 weggooien; 1024 x 1024 pixels), en “Pixel formaat Raw 8”. Onder ‘ Trigger / Strobe’, de trigger input lijn (GPIO) ingesteld op “3”, de polariteit op “Hoog”, de ‘Mode’ tot en met “14”. In-/ uitschakelen ‘Inschakelen’ te stoppen frame overname totdat een TTL trigger-signaal wordt ontvangen. Laat dit venster open en klik op de rode “Record” knop op de Weergavewerkbalk hoofdcamera. Selecteer de map voor beeldsequenties om gered te worden. Selecteer ‘Buffered’ opnamemodus en ‘Afbeeldingen’ in JPEG-indeling worden opgeslagen. Klik op “Start opname” om te initialiseren van de overname. Fluorescentie camera en beeld splitterOpmerking: GCaMP5 en mCherry fluorescentie kanalen moeten worden verzameld gelijktijdig om ervoor te zorgen de juiste beeldregistratie voor ratiometric kwantificatie. Een afbeelding splitter kunt twee-kanaals verwerving van de fluorescentie van het GCaMP5 en mCherry op een sensor. In het tabblad ‘Capture’ van de afbeelding acquisitie software (Zie Tabel of Materials), ingestelde belichtingstijd tot 10 ms, weggooien 4 x en diepte naar 16-bits. Selecteer een gecentreerde camera subarray van 512 pixels breed op 256 pixels hoog. Klik op ‘Toon Trigger uitvoeropties’ en stel alle Triggers tot ‘Positief’.Opmerking: De DAQ kan af en toe TTL triggers missen als ze 10 ms of minder. Controleer of ‘Trigger 1’ en ‘Trigger 2’ zijn ingesteld op ‘Blootstelling’ terwijl ‘Trigger 3’ is ingesteld op ‘Programmable’ met een ‘periode’ van 25 ms. onder het tabblad ‘Volgorde’, selecteer ‘Time Lapse’ met een ‘veld Delay1’ voor 50 ms voor het verzamelen van beelden bij 20 Hz. Selecteer ‘Bewaar tijdelijke Buffer.’ Bet krijgen en laser intensiteit tijdens drie kanaal confocal imaging Stel de bet winst zodat de achtergrond fluorescentie op een niveau net boven het minimum (Zwartniveau is). 561 nm (groen) laser macht vergroten tot een enkele verzadigde 12-bits of 16-bits pixel wordt waargenomen in de presynaptische terminus in het mCherry-kanaal. 488 nm (blauw) laser intensiteit zodanig aanpassen dat GCaMP5 fluorescentie net zichtbaar in de presynaptische terminus boven achtergrond is. Deze lage instelling blokkeert de verzadiging van de GCaMP5 pixels wanneer de fluorescentie in reactie op de sterke Ca2 + transiënten stijgt. Open de confocal pinhole helemaal naar het maximaliseren van licht vangen. 3. Ratiometric Ca2 + beeldvorming en gedrag opname Onder het tabblad ‘Volgorde’ in de fluorescentie acquisitie software, klikt u op “Start” om te beginnen met opnemen. Het bijhouden van de worm met de joystick, houden de cel(len) en synapsen van belang in focus en in het midden van het gezichtsveld (FOV). Klik op de knop ‘Statistieken’ in het histogram weer te geven van de pixel statistieken van elk kanaal. Aanpassen van de LED power om een maximale mCherry van single-pixel fluorescentie bij de presynaptische eindpunt van ≥ 8.000 graven (~ 4000 photoelectrons), geven een ~ 12-bits dynamisch bereik boven achtergrond (~ 100 photoelectrons). GCaMP5 signalen in de presynaptische terminus tijdens rust (lage) Ca2 + ongeveer moet ~ 2.500 telt – net zichtbaar boven de achtergrond. Record totdat één ei leggen van actieve toestand wordt bereikt; Dit treedt meestal op elke 20-30 min in een wild-type worm7. Een subset van de 10-min (12,001 frames), 6.000 frames voor en na het eerste ei leggen van evenement (frame 6,001) opslaan. Zorg ervoor dat het dezelfde subset van helderveld beelden van worm gedrag en timepoints van XY fase positie of de nauwkeurige synchronisatie van gegevensstromen zullen verloren gaan. ImageJ en de BioFormats plugin gebruiken (Zie Tabel van materialen) afbeeldingsreeksen converteren naar Image Cytometry standaard (.ics) formaat zodat het kan worden geïmporteerd in de kwantificatie van de Ratiometric software. 4. segmentatie en kwantitatieve analyse van het beeld Afbeeldingsreeksen importeren de kwantificatie van de Ratiometric software (Zie Tabel van materialen). Klik op ‘Auto Contrast’ in het menu ‘Extra’ en helderheid van elk kanaal om passende zwart (~ 1800) en witte niveaus (10.000). Selecteer ‘Kleuren wijzigen…’ in het menu Extra om te bevestigen dat de mCherry en GCaMP5 kanaal Kleurtoewijzingen juiste (Figuur 4A – C zijn). Klik met de rechtermuisknop op de tijdreeksen in het tabblad ‘Reeks’ en stel deze in op 20 frames/s en 1,25 µm/pixel. Selecteer ‘Verhouding’ in het menu ‘Extra’ en selecteer “GCaMP5” voor “Kanaal A” en “mCherry” voor ‘Kanaal B’. Klik op “Bereken” naast ‘Drempel’ aftrekken van de achtergrond van elke reeks afbeeldingen. Selecteer “Apply een regenboog LUT naar de verhouding kanaal”.Opmerking: Voor een opname met een gemiddelde basislijn ratio van 0,3 (lage Ca2 +) en een max ratio van 2-3 (hoge Ca2 +), een geschikte opzoektabel zou moet tussen 0 (blauw) en 1 (rood). Het genereren van een kanaal van de intensiteit gemoduleerd verhouding met behulp van het mCherry kanaal (Figuur 4D). De intensiteit gemoduleerd Ratio-kanaal is een miljoenen-van-kleuren beeld waar de verhouding kleur op de helderheid van het mCherry-kanaal is toegewezen. Maak een object-zoeken-protocol door te slepen van de tool ‘Vind objecten met behulp van intensiteit’ naar het ‘Protocol’-deelvenster onder het tabblad ‘Metingen’. Klik op de ‘cog’ voor het instellen van het venster van mCherry intensiteitswaarden en objecten te vinden. Selecteer intensiteit waarden ≥ 2 standaarddeviaties (SD) boven achtergrond (bijvoorbeeld ondergrens van ~ 2500, bovengrens van 65.535). Controleer of het presynaptische eindpunt wordt gedetecteerd en dat “automatisch bijwerken feedback’ is geselecteerd in het menu van de metingen.Opmerking: Kan de software ook objecten identificeren door hun standaardafwijking van de achtergrond met behulp van een verwante protocol ‘SD Intensity.’ Echter, als een bijzonder helder object de FOV invoert, het kan drastisch veranderen de gemiddelde intensiteit tijdens deze timepoints, beïnvloeden de intensiteit cutoffs gebruikt om te vinden de HSN. Deze variabiliteit zal niet optreden als ruwe intensiteitswaarden worden gebruikt om objecten te zoeken. Voeg extra filters gericht op alleen het mCherry kanaal (grootte, Max intensiteit, enz.) zo nodig uit te sluiten van ongewenste objecten zoals hoofd, staart, en gut fluorescentie. Selecteer ‘Maken meting Item’ in het menu van de metingen en kies ‘Alle Timepoints.’Opmerking: Dit zal uitvoeren van het protocol, schrijven alle metingen naar een door komma’s gescheiden waarden (.csv)-bestand dat moet worden geëxporteerd met de opdracht ‘exporteren’ in het menu bestand. Openen exported.csv bestand en kopieer Timepoint, gebied (µm2) gemiddelde (verhouding kanaal), Centroid X (µm) en Centroid Y (µm) gegevens in een nieuw blad. A.csv-exportbestand zonder kolomkoppen. De kwantificatie van de Ratiometric-software kan in een cel van belang als een of meer objecten per timepoint indelen. Om deze objecten te hergroeperen, een aangepast script ‘AnalzyeGCaMP_2017.m’ te gebruiken.Opmerking: Het script ook identificeert Ca2 + (ratio) pieken in de gegevens, en slaat a.csv bestand van hun timepoints, piekamplitudes en piek breedtes. Het genereert ook PostScript-bestanden voor de ruwe en geannoteerde verhouding sporen. Met deze informatie, moeten Ca2 + voorbijgaande amplitude en inter voorbijgaande interval worden bepaald. De output X en Y centroid waarden uit elk fluorescentie-object toevoegen aan de X- en Y-waarden opgenomen door het script van de XY-fase van Bonsai. De nettopositie van de XY gebruiken voor het genereren van een worm motoriek spoor en voor de berekening van de cel verplaatsing en snelheid die gepaard gaan met verschillende gedrag verklaart31. De beelden opgenomen helderveld in ImageJ importeren als een virtuele stapel. Ei-leggen gebeurtenissen en andere gedragingen van aantekeningen voorzien. De timing van deze gebeurtenissen te vergelijken met Ca2 + pieken van de verhouding trace.

Representative Results

De eenvoudige montage techniek hier beschreven (Figuur 1) zorgt ervoor dat minimale veranderingen in de omgeving van de cultuur van L4 en volwassen C. elegans terwijl het toestaan van hoge resolutie opname in het gedrag van dieren door een glas dekglaasje aan (Figuur 4). Synchronisatie van LED lichtbronnen, fase controllers en posities van de camera maakt het mogelijk voor data-acquisitie van meerdere streams op 20 frames/s voor tot aan 1 h. Intermediate vergroting (20 x) met hoge numerieke diafragma doelstellingen (0.7-0.8) biedt goede ruimtelijke resolutie van de synaptische regio in het leggen van eieren gedrag circuit, zelfs met 4 x 4 pixel weggooien (1,25 µm/pixel). Gelijktijdige aankoop van GCaMP5 en mCherry fluorescentie-signalen (Figuur 4A, B) wordt gebruikt voor het genereren van een pixel-bij-pixel verhouding kanaal dat wijzigingen in dierlijke verkeer en focus (Figuur 4D) compenseert. Het HSN presynaptische terminus is zo groot als veel neuronale cel organen in C. elegansen wijzigingen in de presynaptische HSN Ca2 + kunnen duidelijk worden gevisualiseerd. De grote FOV van de infrarood helderveld camera kunt de worm handmatig worden bijgehouden tijdens opname (Figuur 4E). Voor elk dier, kunnen wijzigingen in intracellulaire Ca2 + worden gecorreleerd met gedrag duidelijk in helderveld imaging inclusief ei release en wijzigingen in de motoriek (Figuur 4E). Kwantificatie van HSN Ca2 + en snelheid bevestigt dat wormen hun motoriek veranderen als ze de overgang naar ei leggen van gedrag. Er zijn aanzienlijke verschillen in de snelheid van de worm vóór, tijdens en na het leggen van eieren actieve toestand (Figuur 5A). Dit wordt niet veroorzaakt door lawaai die inherent zijn aan de beeldvorming of tracking systeem. Zoomen in één gebeurtenis van de ei-leggen, zien we een sterke verandering in GCaMP5 fluorescentie (ΔF/F) voorafgaand aan het evenement van ei-leggen terwijl mCherry fluorescentie relatief is ongewijzigd (Figuur 5B). Gemeten veranderingen in de verhouding van de GCaMP5:mCherry (ΔR/R) duidelijk een HSN Ca2 + voorbijgaande ~ 4 s voorafgaand aan de release van de ei (Figuur 5B). Samenvallen met vulval spiercontractie, een duidelijke vertraging van de worm motoriek optreedt dat eindigt met ei vrijgeven. Vorige resultaten hebben aangetoond dat de cholinerge VC motorische neuronen, die zijn geïnnerveerd door de HSNs, piek activiteit tijdens sterke vulval spiercontracties en ei release 8,10,27 tonen. We hebben ook aangetoond dat optogenetic activering van de neuronen VC drijft een onmiddellijke vertragen van voortbewegen, wat suggereert dat de VC neuronen kunnen worden geactiveerd door vulval spiercontractie, aldus motoriek vertragen tot de ontvangen feedback van ei release27 . De beeldvorming en een tracking systeem beschreven kunt visualisatie van de ruimtelijke organisatie van ei leggen van gedrag (Figuur 5C). Zoals eerder getoond, wormen Voer aanhoudende loopt van vooruit voortbewegen vlak voor de actieve toestand32. Wormen besteden het merendeel van hun tijd fourageren op bacteriën in het midden van de agar Brok. Vóór inwerkingtreding van de actieve status, is wormen afgestapt van het voedsel, die samenvallen met de verschijning van zeldzaam HSN Ca2 + transiënten. HSN activiteit vervolgens overgaat in burst afvuren, met verschillende nauw verdeelde HSN Ca2 + transiënten die ei leggen van gebeurtenissen ondersteunen. De wormen vervolgens vaak omdraaien, hervatten vooruit voortbewegen en leggen eieren op de weg terug naar hun uitgangspositie in de buurt van de OP50-bacteriën. Wij gaan ervan uit dat wijzigingen in de lokale O2 en/of CO2 -concentratie kunnen worden beïnvloeden wanneer de wormen besluiten te leggen eieren33,34. Figuur 1. C. elegans montage techniek voor hoge resolutie beeldvorming van ei-leggen circuit activiteit en gedrag. Boven, de laatste berg vanaf de zijkant. Bodem, de laatste berg als bekeken door de bodem van de grote dekglaasje aan. Pijlen geven aan OP50 bacteriële voedsel, C. elegans wormen en eieren, ingeklemd tussen de NGM agar Brok en de grote 24 x 60 mm dekglaasje aan. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 2 . Widefield ratiometric Ca2 + beeldvorming en gedrag opnemen op een omgekeerde epifluorescence microscope. (A) Worm standpunt en gedrag is gevangen in helderveld via een 20 x (0.8 nvt) Plan-Apochromat doel met behulp van infrarood (750-790 nm) licht (paarse pijlen) door een halogeenlamp via de NGM ΘΘnheid uitgestoten. Een joystick en gemotoriseerde fase controller wordt gebruikt om de worm in het gezichtsveld tijdens het opnemen. Fase positie (Δx, Δy) wordt verzonden naar de PC via de seriële poort. GCaMP5 en mCherry eiwitten, uitgedrukt in de worm zijn opgewekt met behulp van 470 nm (blauwe pijlen) en 590 nm (gele pijlen) Light Emitting Diodes (LED). Uitgestraalde GCaMP5 (groene pijlen) en mCherry (oranje pijlen) fluorescentie samen met de infrarood licht een multi-band dichroïde spiegel passeert (Zie Tabel van materialen). 20% van het licht via een 0.63 x demagnifer voor het vastleggen van stuurt een 80/20 beam-splitter op een infrarood-gevoelige CMOS camera (paarse pijl). De resterende 80% van het licht via de zijkant-poort van de Microscoop wordt verzonden naar een afbeelding splitter die scheidt van de GCaMP5 en mCherry fluorescentie op afzonderlijke helften van een sCMOS camera tijdens het verwijderen van infrarood helderveld licht. Gegevens van beide camera’s zijn overgebracht naar een PC via USB3 kabels. De trigger-poorten van de fluorescentie sCMOS camera (blauw) worden gebruikt voor het verzenden van + 5V TTL activeert de LED-verlichting systeem, de infrarood helderveld CMOS-camera en de digitale acquisitie apparaat (DAQ). (B) Trigger 3 uitgang TTL signalen zijn gedetecteerd door de DAQ op digitale pin #8 en verzonden naar de PC via een USB-verbinding. Deze digitale ingangen leiden tot een ‘ waar XY’ seriële opdracht vanuit een Bonsai software script (XY-fase-finale) die leest de X- en Y fase positie voor elk GCaMP5/mCherry fluorescentie/infrarood beeld gevangen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 3 : Lay-out van de Bonsai seriële-stage communicatie script XY-fase-definitieve. De top DigitalInput knooppunt (roze) leest TTL triggers pin #8 van de DAQ binnenkomen. Voor elke positieve TTL spanning (groen), de DAQ maakt een tijdstempel (blauw) en schrijft ‘Waar XY?’ string (roze) naar de fase controller via de seriële poort (grijs). Het SerialStringRead knooppunt (roze) leest dat de X- en Y coördineren reactie van de fase-controller. Deze tekenreeks wordt vervolgens omgezet in micron en onderverdeeld in X en Y coördinaten etappe. Ten slotte, deze vier streams worden gecombineerd met een zip knooppunt (blauw) en een vier column.csv-bestand wordt geschreven: een aantal van de frames van de TTL-signalen ontvangen (bereik knooppunt, roze), de X- en Y-coördinaten en het interval tussen de latere timepoints (meestal ~ 50 ms wanneer opname bij 20 Hz). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 4 : Representatief microfoto van HSN fluorescentie en hele dierlijke helderveld tijdens het leggen van eieren gedrag. (A-D) Beeldvorming van de gelijktijdige ratiometric van GCaMP5 en mCherry fluorescentie in de HSNs vlak voor de release van het ei. HSN presynaptische termini worden aangegeven met pijlpunten. (C) de fluorescentie van samenvoegen van GCaMP5 en mCherry. (D) intensiteit-gemoduleerd GCaMP5:mCherry verhouding; een hoge verhouding (rood) geeft aan hoge intracellulaire Ca2 + in de presynaptische terminus. (E) helderveld beeld van de gehele worm net nadat de eieren zijn gelegd. Pijlpunten geven de anterieure en posterieure helften van de vulva uit die eieren worden gelegd. De bar van de schaal voor alle afbeeldingen is 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 5 : Opname van HSN Ca2 + en motoriek snelheid tijdens het leggen van eieren gedrag. (A) sporen van GCaMP5:mCherry verhouding wijzigingen naar aanleiding van intracellulaire Ca2 + transiënten (ΔR/R; rood) samen met de snelheid van de momentane worm (µm/s; blauw). Ei-leggen gebeurtenissen worden aangeduid met pijlpunten. (B) sporen van HSN GCaMP5 fluorescentie (green; ΔF/F), mCherry-fluorescentie (rood; ΔF/F) GCaMP5:mCherry fluorescentie verhouding (black; ΔR/R) en worm snelheid (blauw) rond het moment van introductie van het ei. (C) ruimtelijke organisatie van ei-leggen en motoriek gedrag tijdens de hele 10-min-opname. De worm track is afkomstig van de XY stadium informatie die werd toegevoegd aan de centroid positie van de HSN deopname fluorescentie mCherry verkregen. De timing van HSN transiënten (rode cirkels), ei-leggen gebeurtenissen (zwarte pijlpunten), en het begin en einde van de opname (groene en blauwe diamanten) zijn aangegeven. De bar van de schaal is 1 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Transgenen:

Omdat mCherry expressie is verbeterd door middel van codon-optimalisatie en intron plaatsingskosten (en meest toegankelijke GCaMP verslaggevers niet hebben), injecteren ~ 4 x de hoeveelheid GCaMP5-uiten plasmide om vergelijkbare niveaus van GCaMP5 fluorescentie tijdens sterke Ca 2 + transiënten. Redding van de lin-15(n765ts) mutatie zorgt voor de facile herstel van transgene dieren met minimale gevolgen voor het leggen van eieren en andere gedrag-35. Transgenen moet worden geïntegreerd om uniforme expressie en imaging voorwaarden tussen verschillende dieren25te waarborgen. Selecteerbare merkers, met inbegrip van antibioticaresistentie36,37 en redding van temperatuurgevoelige lethals38 zou ook moeten werken, maar, omdat niet-transgene dieren dood, bevestiging van transgenic integratie en homozygosity is moeilijker in vergelijking met markeringen die een zichtbare fenotype25presenteren. Dominante markeringen die normale motoriek verstoren en verlagen van fitness, zoals rol-6(dm), moeten worden vermeden39. Beeldvorming in de lite-1 is mutant achtergrond essentieel om te verminderen van blauw licht ontsnappen reacties tijdens imaging23,40,41. Extra mutatie van gur-3, die parallel aan lite-1fungeert, kan verdere minimaliseren residuele gedrag en fysiologische veranderingen veroorzaakt door blauw licht42. Gunstig, gur-3, lite-1en lin-15 liggen allemaal op de rechterhelft van chromosoom X, die de bouw van nieuwe stammen voor Ca2 + beeldvorming en optogenetic experimenten moet vereenvoudigen.

Omdat de belichtingstijden zijn kort en afbeeldingen worden verzameld bij 20 Hz, moeten GCaMP5 en mCherry signalen worden helder. De meest waarschijnlijke verklaring voor luidruchtige Ca2 + opnamen is dim fluorescentie veroorzaakt door zwakke verslaggever expressie. Initiatiefnemers moeten ook redelijk specifiek voor de regio image wordt gemaakt. Omdat de HSN cel lichaam en synapsen op de vulval spieren zich in het midden van het lichaam, extra uitdrukking van de nlp-3 promotor in het hoofd en de staart is meestal buiten het gezichtsveld en kan worden uitgesloten met behulp van extra filters in de Ratiometric Quantitation software. Om ervoor te zorgen dat wijzigingen in het resultaat van de fluorescentie van de GCaMP5 van werkelijke wijzigingen waargenomen in intracellulaire Ca2 +, controle transgenen uiten GFP in plaats van GCaMP5 onafhankelijk moeten worden voorbereid en geanalyseerd26. Nieuwere Ca2 + verslaggevers met verschillende Ca2 + gevoeligheden kinetiek en kleuren hebben uitgebreid de keuze van imaging tools beschikbaar, maar elke nieuwe verslaggever moet worden gevalideerd met behulp van de Ca2 +-ongevoelig fluorescerende variant14 ,16.

Media:

NGM platen voor imaging moeten bereid zijn met hoge kwaliteit agar. Lagere kwaliteit agar zal niet volledig oplossen op autoclaaf, verlaten van kleine deeltjes die scatter licht tijdens imaging, en verhoging van fluorescentie van de achtergrond. Moleculaire biologie rang agarose in plaats daarvan kan worden gebruikt, maar de toegevoegde hoeveelheid moet worden verlaagd om gelijkwaardige plaat stevigheid.

Vergelijkingen met andere montage methoden:

Vorige afbeelding activiteit in het leggen van eieren gedrag circuit benaderingen hebben wormen geïmmobiliseerd met lijm op een agarose pad gebruikt. Onder deze omstandigheden, circuit activiteit en ei leggen van gedrag is niet favoriet zonder een afname van de voedingsbodems osmolariteit8,10,44,45. Recent bewijs suggereert dat verschillende worm gedrag gemoduleerd worden door motoriek staat, vragen stellen over de relatie van cel activiteit waargenomen in geïmmobiliseerdet dieren die in vrij gedragen dieren gezien. We hebben onlangs aangetoond dat ei leggen van circuit activiteit is onverwacht geleidelijk met motoriek26,27. Evenzo integreert verzuilde Ca2 + signalering in de RIA interneuron activiteit van de sensorische neuronen en hoofd motorische neuronen tijdens het foerageren bewegingen46. Ontlasting gedrag gaat ook gepaard met een precieze en stereotiepe verandering in motoriek waarmee dieren uit de buurt van hun foerageren plek verplaatst voordat het verdrijven van afval47. Samen, suggereren deze resultaten dat korte opnames van activiteit van het circuit van geïmmobiliseerdet dieren fundamenteel verschilt van die in vrij gedragen dieren verkregen kunnen worden.

Ondanks het feit dat direct onder een dekglaasje aan, van de worm gedrag lijkt op dat gezien op standaard NGM platen. Vastgestelde eieren zal gaan uitkomen en de kleine hoeveelheid voedsel gestort kunt de L1 larven uitgroeien tot volwassenen (gegevens niet worden weergegeven). De grootte van de chunk grote agar zorgt voor redelijke Gaswisseling en verzet zich tegen uitdroging, hoewel teveel voedsel achtergrond fluorescentie zal toenemen. Terwijl deze methode het beste voor volwassenen werkt, kan de techniek ook worden gebruikt om de afbeelding L4 dieren. De dikte van de waterige laag tussen het blok en het dekglaasje aan is echter zodanig dat kleinere larven ondervindt bij het kruipen, en vaak krijgen in het kielzog van een bewegende volwassene gevangen kunnen.

Een beperking van deze montage techniek is dat rechtstreekse mechanische of chemische stimulatie voor precieze gebieden van het lichaam moeilijk is. Recente ontwikkelingen in patroon verlichting technieken zorgen voor de aparte excitatie van kop of staart-uitgedrukt microbiële opsins met aparte verlichting en opsporing van GCaMP/mCherry fluorescentie in de midbody48,–49. Dientengevolge, het mogelijk om dit probleem met behulp van optogenetic benaderingen.

Vergelijkingen met andere Ca 2 + Imaging benaderingen:

Deze methode werkt erg goed voor het vastleggen van wijzigingen in cytoplasmatische Ca2 + van eenpersoons, cellen en hun synaptic regio’s opgelost. Real-time, volumetrische beeldvorming van neuronen in het hoofd is onlangs geboekt met behulp van de positie van celkernen voor cel identificatie en te kwantificeren van veranderingen in nucleoplasmic calcium50,51,52. De relatie tussen nucleaire en synaptische Ca2 + blijft onduidelijk. Onze gegevens blijkt dat de meest opvallende veranderingen in HSN intracellulaire Ca2 + optreden bij de presynaptische termini uit de buurt van de cel soma (Figuur 4 d). De presynaptische termini van de HSN en de VC neuronen zijn ingebed in de postsynaptisch vulval spieren26. Het is niet duidelijk of er zou voldoende resolutie in de Z-dimensie zelfs met draaiende schijf of lichte blad technieken om het toeschrijven van exocytose Ca2 + signalen naar specifieke cellen zonder te vertrouwen op een bepaalde manier op somatische calcium voor identificatie van de cel . Met behulp van de technieken die hier worden beschreven, elke 10 min, twee-kanaals opname met 12,001 256 x 256 pixels van de 16-bits TIFF-afbeeldingen is ~ 4 GB. De verhouding en intensiteit gemoduleerde verhouding kanalen dubbele de bestandsgrootte ~ 8 GB. Een typisch experiment opname 10 dieren uit elk van de twee genotypen (wild-type en experimentele) genereert bijna 150 GB primaire gegevens en vereist 20u te verzamelen en te analyseren. Volumetric analyses met 10 Z plakjes per timepoint zou vereisen een grootteorde meer gegevens en analytische tijd, uit te leggen waarom zo weinig dergelijke studies hebben voltooid.

Hardware:

Wij registreren en analyseren van afbeeldingsreeksen op dual-processor werkstations met hoge prestaties (bijvoorbeeld gaming) grafische kaarten, 64 GB RAM, en krachtige solid-state schijven (Zie Tabel van materialen). Gegevens moeten worden opgeslagen op de genetwerkte redundante matrix van onafhankelijke schijven (RAID) en back-up naar de wolk op een off-site datacenter.

Het is raadzaam om met behulp van high-power LEDs collimated voor gepulseerde fluorescentie excitatie over metaalhalogenide of kwik-gebaseerde lichtbronnen. Verschillende verkrijgbare Multi-Color LED systemen zijn beschikbaar. Terwijl sommige van deze LED systemen een hogere upfront kosten hebben, kunnen ze hebben een lange levensduur (> 20.000 h), tegelijkertijd prikkelen van vier of meer verschillende fluorophores en bieden nauwkeurige temporele controle met behulp van een seriële en/of TTL interface met lage latentie (10-300 µs schakelen tijd). Triggering zorgt ervoor dat het monster alleen brandt wanneer daadwerkelijk gegevens worden verzameld. Wij gebruiken meestal een 10 ms belichting elke 50 ms (tarief van de plicht van de 20%). Dit vermindert fototoxiciteit en bewegingsonscherpte tijdens het opnemen van de afbeelding, als eerder gemeld43.

We gebruiken sCMOS camera’s voor hun snelheid en groot scala aan kleine, gevoelige pixels. Een EM-CCD-camera is een duurder alternatief, maar ‘bloom’ effecten kunnen leiden tot een vastgelegde photoelectrons morsen in aangrenzende pixels. Nieuwe terug verlichte sCMOS camera’s hebben gelijksoortige photosensitivity van EM-CCD’s tegen aanzienlijk lagere kosten. Ongeacht moeten welke sensor wordt gebruikt, de GCaMP5 en mCherry kanalen worden verkregen gelijktijdig. Sequentiële vastleggen bij het verplaatsen van wormen zal leiden tot slecht geregistreerde beelden ongeschikt voor ratiometric kwantificatie. Dual-channel beeldvorming kan worden bereikt op een enkele camera na de splitsing van kanalen met behulp van een afbeelding splitter (Figuur 2) of met behulp van twee identieke camera’s. Het dynamisch bereik van 16-bits afbeeldingen wordt aangeraden via 8-bits afbeeldingen voor nauwkeurige ratiometric kwantificatie. Voor helderveld beelden van worm gedrag vangen wij met behulp van een 1 inch 4.1 MP nabij-infrarood USB3 camera te vangen van grote 2 x 2 weggegooid 1024 x 1024 8-bit beeldsequenties na JPEG compressie. De grotere FOV beschikbaar op nieuwere modellen van de Microscoop kunt een volwassen worm worden gevisualiseerd op 20 x na 0.63 x demagnification met alleen lichte vignettering (figuur 4E).

Het is raadzaam om met behulp van standaard TTL spanning signalen om verlichting en frame vastleggen te synchroniseren. Vanwege de potentiële latencies in verschillende softwareprogramma’s, is het raadzaam de gebruikers configureert de fluorescentie-camera met trigger uitgangen als master met TTL uitgangen rijden alle andere apparaten. Op deze manier zal helderveld en podium positie-informatie worden verzameld voor elke Ca2 + meting.

Gleuf- of resonant punt-scannen confocal microscopen meestal gevonden in gedeelde confocal faciliteiten geven ook uitstekende prestaties tijdens ratiometric Ca2 + imaging. Dergelijke instrumenten kunnen worden gebruikt om vast te leggen van twee of meer fluorescentie kanalen samen met helderveld24. In dit geval de confocal pinhole zou moeten worden opengesteld voor de maximale diameter en een spectrale detector moet worden gebruikt voor het scheiden van GCaMP5, mCherry en infrarood helderveld signalen. Dit lichte collectie uit een dikke maximaliseert (~ 20 µm) segment terwijl nog steeds afwijzing van out-of-focus fluorescentie. Een nadeel is de kleinere FOV en meer beperkingen voor het aanpassen van de hardware en software.

Software:

De meeste fabrikanten schip en installeer van hun camera’s en microscopen met propriëtaire software, waaronder de configuratie van de startconditie inputs en outputs. De functies en de prestaties van deze software tijdens opname kunnen variëren. Omdat het snel verplaatsen van wormen kan lastig zijn om bij te houden, beeldweergave tijdens de opname moet worden glad en stabiel bij 20 Hz. Om prestaties te verbeteren, kunnen beeldsequenties worden tijdelijk opgeslagen in het RAM met gedragsgestoorde relevante deelverzamelingen opgeslagen aan het einde van het experiment. Deze reeks van twee-kanaals afbeeldingsbestanden kunnen worden geconverteerd naar de open Image Cytometry standaardindeling (.ics) voor invoer in de kwantificatie van de Ratiometric software. OME-TIFF is een meer recente open-source afbeeldingsindeling, hoewel verschillende installaties mogelijk niet reeksen van TIFF-afbeeldingen groter dan 4 GB opslaan.

Een belangrijk kenmerk van de kwantificatie pijpleiding is de generatie van de verhouding tussen zender en daarna een onbevooroordeelde afbeelding segmentatie procedure met behulp van fluorescentie van de mCherry te vinden van cellen van belang. Van elk gevonden object, de grootte van het object, XY centroid positie en het minimum, betekenen, en maximale fluorescentie intensiteitswaarden voor elk kanaal (met inbegrip van de verhouding kanaal) worden berekend. Samen worden deze waarden gebruikt om te kwantificeren van veranderingen in de intracellulaire Ca2 + op elke timepoint in de opname. Object metingen voor elke timepoint worden vervolgens geëxporteerd als a.csv bestand voor latere analyses.

Een belangrijke beperking van het protocol hier beschreven is de afhankelijkheid van het verplaatsen van de gegevens in verschillende formulieren door een lappendeken van softwareproducten. Een extra irritatie is dat sommige van de software is open-source en gratis, terwijl andere zijn gesloten, duur en ongelijk bijgewerkt. Een belangrijke verbetering zou gebruiken of ontwikkelen van een stukje software (idealiter open-source) die soortgelijke niveaus van prestaties en gemak-of-gebruik van acquisitie tot analyse biedt. Zoals hierboven vermeld, verdubbelt ratiometric analyse de bestandsgrootte en de benodigde tijd voor het voltooien van een experiment. Generatie van camera-stuurprogramma’s die kunnen worden geïntegreerd in de gebruiker aanpasbare kaders als Bonsai beelden en andere gegevensstromen worden verzameld en geanalyseerd in real-time, aanzienlijk verbeteren doorvoer zou toestaan.

Vooruitzichten voor de toekomst:

Terwijl wij handmatig meestal worm bewegingen bijhouden, bijhouden van het zwaartepunt van de worm ontdekt in infrarood licht – of donker-veldopnames ruimte laten voor extra knooppunten die bieden kringloopsysteem aanpassing van fase positie en geautomatiseerd voor beeldverwerking Tracking (Figuur 3 en gegevens niet worden weergegeven). De meerderheid van de opnamen van de fluorescentie verkregen met deze methode is donker en verstoken van biologisch interessante gegevens. Op-sensor of real-time na overname beeldverwerking technieken die beeldsequenties aan relevante objecten bijsnijden zou toestaan voor hogere ruimtelijke resolutie en versnellen van de data-analyse-pijpleiding, met name als extra Z-segmenten worden verzameld voor elk timepoint te visualiseren activiteit binnen alle pre- en postsynaptisch cellen in het circuit.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van NINDS KMC (R01 NS086932). LMN werd gesteund door een subsidie vanuit de NIGMS IMSD programma (R25 GM076419). In deze studie gebruikt stammen C. elegans genetica Center, dat wordt gefinancierd door de NIH kantoor van infrastructuur onderzoeksprogramma (P40 OD010440). Wij danken James Baker en Mason Klein voor nuttige discussies.

Materials

C. elegans growth, cultivation, and mounting
Escherichia coli bacterial strain, OP50 Caenorhabditis Genetic Center OP50 Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. Biosafety Level 1
HSN GCaMP5+mCherry worm strain Caenorhabditis Genetic Center LX2004 Integrated transgene using nlp-3 promoter to drive GCaMP5 and mCherry expression in HSN.  Full genotype:  vsIs183 [nlp-3p::GCaMP5::nlp-3 3'UTR + nlp-3p::mCherry::nlp-3 3'UTR + lin-15(+)], lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X
lite-1(ce314), lin-15(n765ts) mutant strain for transgene preparation author LX1832 Strain for recovery of high-copy transgenes after microinjection with pL15EK lin-15(n765ts) rescue plasmid. Also bears the linked lite-1(ce314) mutation which reduces blue-light sensitivity. Available from author by request
pL15EK lin-15a/b genomic rescue plasmid author pL15EK Rescue plasmid for recovery of transgenic animals after injection into LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X strain. Available from author by request
pKMC299 plasmid author pKMC299 Plasmid for expression of mCherry in the HSNs from the nlp-3 promoter. Has nlp-3 3' untranslated region
pKMC300 plasmid author pKMC300 Plasmid for expression of GCaMP5 in the HSNs from the nlp-3 promoter. Has nlp-3 3' untranslated region
Potassium Phosphate Monobasic Sigma P8281 For preparation of NGM plates
Potassium Phosphate Dibasic Sigma P5655 For preparation of NGM plates
Magnesium Sulfate Heptahydrate Amresco 0662 For preparation of NGM plates
Calcium Chloride Dihydrate Alfa Aesar 12312 For preparation of NGM plates
Peptone Becton Dickinson 211820 For preparation of NGM plates
Sodium Chloride Amresco 0241 For preparation of NGM plates
Cholesterol Alfa Aesar A11470 For preparation of NGM plates
Agar, Bacteriological Type A, Ultrapure Affymetrix 10906 For preparation of NGM plates
60 mm Petri dishes VWR 25384-164  For preparation of NGM plates
24 x 60 mm micro cover glasses, #1.5 VWR 48393-251 Cover glass through which worms are imaged
22 x 22 mm micro cover glasses, #1 VWR 48366-067 Cover glass that covers the top of the agar chunk
Stereomicroscope with transmitted light base Leica M50 Dissecting microscope for worm strain maintenance, staging, and mounting
Platinum iridium wire, (80:20), 0.2mm ALFA AESAR AA39526-BW For worm transfer
Calcium imaging microscope
Anti-vibration air table TMC 63-544 Micro-g' Lab Table 30" x 48" anti-vibration table with 4" CleanTop M6 on 25mm top
Inverted compound microscope Zeiss 431007-9902-000 Axio Observer.Z1 inverted microscope
Sideport L80/R100 (3 position) Zeiss 425165-0000-000 To divert 20% of output to brightfield (CMOS) camera, 80% to fluorescence (sCMOS) camera
Tilt Back Illumination Carrier Zeiss 423920-0000-000 For infrared/behavior imaging
Lamphousing 12V/100W w/ Collector Zeiss 423000-9901-000 For infrared/behavior imaging
Halogen lamp 12V/100W Zeiss 380059-1660-000 For infrared/behavior imaging. White-light LEDs do not emit significant infrared light, so they will not allow brightfield imaging after the infrared bandpass filter
32 mm Infrared bandpass filter (750-790 nm) for Halogen lamp Zeiss 447958-9000-000 BP 750-790; DMR 32mm, for infrared illumination for brightfield and behavior
6-filter Condenser Turret (LD 0.55 H/DIC/Ph), Motorized Zeiss 424244-0000-000 For infrared/behavior imaging
Condenser & Shutter Zeiss 423921-0000-000 For infrared/behavior imaging
Binocular eyepiece with phototube for infrared CMOS camera Zeiss 425536-0000-000 For infrared/behavior imaging
Eyepiece 10x, 23mm Zeiss 444036-9000-000 For worm localization on the agar chunk
C-Mount Adapter 2/3" 0.63x demagnifier Zeiss 426113-0000-000 Mount for infrared CMOS camera
CMOS camera for infrared brightfield and behavior (1" sensor) FLIR (formerly Point Grey Research) GS3-U3-41C6NIR-C Camera for brightfield imaging
USB 3.0 Host Controller Card FLIR (formerly Point Grey Research) ACC-01-1202 Fresco FL1100, 4 Ports
8 pins, 1m GPIO Cable, Hirose HR25 Circular Connector  FLIR (formerly Point Grey Research) ACC-01-3000 Cable for TTL triggering. The green wire connects to GPIO3 / Pin 4 and the brown wire connects to Ground / Pin 5
Plan-Apochromat 20x/0.8 WD=0.55 M27 Zeiss 420650-9901-000 Best combination of magnification, numerical aperture, and working distance
6-cube Reflector Turret, Motorized Zeiss 424947-0000-000 For fluorescence imaging
Fluorescence Light Train, Motorized Zeiss 423607-0000-000 For fluorescence imaging
Fluorescence Shutter Zeiss 423625-0000-000 For fluorescence imaging
GFP and mCherry dual excitation and emission filter cube (for microscope) Zeiss 489062-9901-000 FL Filter Set 62 HE BFP+GFP+HcRed for fluorescence imaging
LED illumination system Zeiss 423052-9501-000 Triggerable Colibri.2 LED system for fluorescent illumination
GFP LED module (470 nm) Zeiss 423052-9052-000 Colibri.2 LED for GFP fluorescence excitation
mCherry LED module (590 nm) Zeiss 423052-9082-000 Colibri.2 LED for mCherry fluorescence excitation
Iris stop slider for incident-light equipment Zeiss 000000-1062-360 Field aperture iris to limit LED illumination to the camera field of view
C-Mount Adapter 1" 1.0x Zeiss 426114-0000-000 Adapter for image-splitter and sCMOS fluorescence camera
Image splitter Hamamatsu A12801-01 Gemini W-View, other image splitters may be used, but they may not be optimized for the large sensor size of the sCMOS cameras
GFP / mCherry dichroic mirror (image splitter) Semrock Di02-R594-25×36 Splitting GCaMP5 from mCherry and infrared signals
GFP emission filter (image splitter) Semrock FF01-525/30-25 Capturing GCaMP5 fluorescence
mCherry/ emission filter (image splitter) Semrock FF01-647/57-25 This filter is necessary to exclude the infrared light used for brightfield imaging
sCMOS camera for fluorescence (1" sensor) Hamamatsu A12802-01 / C11440-22CU Orca FLASH 4.0 V2. Newer models allow for separate image acquisition settings on separate halves of the sensor, allowing acquisition of two-channel images in combination with an image splitter
Motorized XY Stage Märzhäuser SCAN IM 130 x 100 Stage movement; the XY resolution of this stage is 0.2µm per step 
XY Stage controller with joystick LUDL MAC6000, XY joystick Manual tracking of worms. MAC6000 controller should be connected to the PC through the serial (RS-232) port configured to 115200 baud
Digital Acquisition board (DAQ) Arduino Uno Receiving TTL triggers from sCMOS camera. The Uno should be loaded with the standard Firmata package, and the computer USB port configured to 57600 baud
BNC Male to BNC Male Cable – 6 ft Hosa Technology HOBB6 BNC connectors for TTL triggering
Gold-Plated BNC Male to SMA male coaxial cable (8.8") uxcell 608641773651 To connect the fluorescence camera trigger outputs
BNC turn head adapter Hantek RRBNCTH21 BNC to Banana Plug Adapter (4mm)
BNC female to female connector Diageng 20130530009 Female to female BNC adapter to connect the BNC output from the camera to the Banana Plug
Solderless flexible breadboard jumper wires Z&T GK1212827 To connect the BNC trigger outputs to the Arduiono DAQ.  Male to male.
High performace workstation HP Z820 Windows 7, 64GB RAM, Dual Xeon processor, solid state C: drive, serial (RS-232) port, multiple PCIe3 slots for ethernet connectivity, USB 3.0 cards, and additional solid state drives
M.2 Solid state drive Samsung MZ-V5P512BW High-speed streaming and analysis of image data
M.2 Solid state drive adapter for workstations Lycom DT-120 M.2 to PCIe 3.0 4-lane adapter
Network attached storage Synology DS-2415+ Imaging data storage and analysis
Hard disk drives Western Digital WD80EFZX RED 8 TB, 5400 RPM Class SATA 6 Gb/s 128MB Cache 3.5 Inch. Storage of imaging data (10 drives + 2 drive redundancy)
Software
Fluorescence Acquisition Hamamatsu HCImage DIA Recording of two channel (GCaMP5 and mCherry) fluorescence image sequences at 20 fps
Brightfield Acquisition FLIR (formerly Point Grey Research) Flycapture Recording of brightfield JPEG image sequences
Stage Serial Port Reader Bonsai https://bitbucket.org/horizongir/bonsai Facilitates tracking of worms during behavior
LED controller software Zeiss Micro Toolbox Test 2011 To set up the intensity and trigger inputs for the different LEDs in the Colibri.2 unit
ImageJ  NIH https://imagej.net/Fiji/Downloads Simple review of image sequences and formatting changes for import into Ratiometric Quantitation software
Excel Microsoft  2002984-001-000001 For generating subsets of comma-separated value data from Volocity for MATLAB analysis
Peak Finding MATLAB R2017a Script used for Ratio peak feature calculations
Ratiometric Quantitation Perkin Elmer Volocity 6.3 Facilitates calculation of ratiometric image channels, image segmentation for object finding, and ratio measurement of found objects
Scripts
AnalyzeGCaMP_2017.m MATLAB Mean Ratio and XY centroid script Analyzes a ratiometric output in .csv format, consolidating objects and centroid positions, calculating ratio changes (∆R/R), identifying peaks and peak features, and writing plots (with and without annotated peaks) in postscript format. For matrix file import, the script will output data into three folders:  analyzed, peaks, and traces. 'Analyzed' output is a matrix file of the consolidated objects with six columns (units):  time (s), area (square microns), ratio, X centroid (microns), Y centroid (microns), and ∆R/R. 'Peaks' output is a matrix file of the timepoints of found peaks, the amplitude (in ∆R/R), the peak width (s), and the prominance of the peak. 'Traces' output are postscript files of calcium traces.
XY-stage-final.bonsai Bonsai TTL-triggered DAQ and stage position serial port reader Records X and Y stage position (in microns) when the attached Arduino receives a positive TTL signal from sCMOS camera during frame exposure. Script writes a .csv file with four columns: frame number, X position (microns), Y position (microns), and the time elapsed between frames (typically ~50 msec when recording at 20 fps).  X and Y stage position from this output (columns 2 and 3, respectively) are added to the X and Y centroid positions from the AnalyzeGCaMP_2017.m MATLAB script (columns 4 and 5, respectively), to give the final X and Y position of the fluorescent object for the recording. 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Phil Trans R. Soc. 314, 1-340 (1986).
  2. Bargmann, C. I. Neurobiology of the Caenorhabditis elegans genome. Science. 282, 2028-2033 (1998).
  3. Piggott, B. J., Liu, J., Feng, Z., Wescott, S. A., Xu, X. Z. S. The neural circuits and synaptic mechanisms underlying motor initiation in C. elegans. Cell. 147, 922-933 (2011).
  4. Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. In vivo neuronal calcium imaging in C. elegans. J. Vis. Exp. JoVE. , (2013).
  5. Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
  6. Desai, C., Garriga, G., McIntire, S. L., Horvitz, H. R. A genetic pathway for the development of the Caenorhabditis elegans HSN motor neurons. Nature. 336, 638-646 (1988).
  7. Waggoner, L. E., Zhou, G. T., Schafer, R. W., Schafer, W. R. Control of alternative behavioral states by serotonin in Caenorhabditis elegans. Neuron. 21, 203-214 (1998).
  8. Zhang, M., et al. A self-regulating feed-forward circuit controlling C. elegans egg-laying behavior. Curr. Biol. CB. 18, 1445-1455 (2008).
  9. Shyn, S. I., Kerr, R., Schafer, W. R. Serotonin and Go modulate functional states of neurons and muscles controlling C. elegans egg-laying behavior. Curr. Biol. CB. 13, 1910-1915 (2003).
  10. Zhang, M., Schafer, W. R., Breitling, R. A circuit model of the temporal pattern generator of Caenorhabditis egg-laying behavior. BMC Syst. Biol. 4, 81 (2010).
  11. Kerr, R. A., Schafer, W. R. Intracellular Ca2+ imaging in C. elegans. Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 351, 253-264 (2006).
  12. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
  13. Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. eLife. 5, (2016).
  14. Inoue, M., et al. Rational design of a high-affinity, fast, red calcium indicator R-CaMP2. Nat. Methods. 12, 64-70 (2015).
  15. Oheim, M., et al. New red-fluorescent calcium indicators for optogenetics, photoactivation and multi-color imaging. Biochim. Biophys. Acta. 1843, 2284-2306 (2014).
  16. Chen, T. -. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499, 295-300 (2013).
  17. Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nat. Rev. Neurosci. 18, 222-235 (2017).
  18. Storace, D., et al. Toward Better Genetically Encoded Sensors of Membrane Potential. Trends Neurosci. 39, 277-289 (2016).
  19. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Génétique. 77, 71-94 (1974).
  20. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
  21. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J. Vis. Exp. JoVE. , (2008).
  22. Clark, S. G., Lu, X., Horvitz, H. R. The Caenorhabditis elegans locus lin-15, a negative regulator of a tyrosine kinase signaling pathway, encodes two different proteins. Génétique. 137, 987-997 (1994).
  23. Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6, 198 (2008).
  24. Thapaliya, E. R., et al. Bioimaging with Macromolecular Probes Incorporating Multiple BODIPY Fluorophores. Bioconjug. Chem. 28, 1519-1528 (2017).
  25. Mariol, M. -. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. J. Vis. Exp. JoVE. , e50773 (2013).
  26. Collins, K. M., Koelle, M. R. Postsynaptic ERG Potassium Channels Limit Muscle Excitability to Allow Distinct Egg-Laying Behavior States in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 33, 761-775 (2013).
  27. Collins, K. M., et al. Activity of the C. elegans egg-laying behavior circuit is controlled by competing activation and feedback inhibition. eLife. 5, e21126 (2016).
  28. Li, P., Collins, K. M., Koelle, M. R., Shen, K. LIN-12/Notch signaling instructs postsynaptic muscle arm development by regulating UNC-40/DCC and MADD-2 in Caenorhabditis elegans. eLife. 2, 00378 (2013).
  29. Banerjee, N., Bhattacharya, R., Gorczyca, M., Collins, K. M., Francis, M. M. Local neuropeptide signaling modulates serotonergic transmission to shape the temporal organization of C. elegans egg-laying behavior. PLoS Genet. 13, 1006697 (2017).
  30. Lopes, G., et al. Bonsai: an event-based framework for processing and controlling data streams. Front. Neuroinformatics. 9, 7 (2015).
  31. Flavell, S. W., et al. Serotonin and the neuropeptide PDF initiate and extend opposing behavioral states in C. elegans. Cell. 154, 1023-1035 (2013).
  32. Hardaker, L. A., Singer, E., Kerr, R., Zhou, G., Schafer, W. R. Serotonin modulates locomotory behavior and coordinates egg-laying and movement in Caenorhabditis elegans. J. Neurobiol. 49, 303-313 (2001).
  33. Ringstad, N., Horvitz, H. R. FMRFamide neuropeptides and acetylcholine synergistically inhibit egg-laying by C. elegans. Nat. Neurosci. 11, 1168-1176 (2008).
  34. Hallem, E. A., et al. Receptor-type guanylate cyclase is required for carbon dioxide sensation by Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 254-259 (2011).
  35. Tanis, J. E., Moresco, J. J., Lindquist, R. A., Koelle, M. R. Regulation of serotonin biosynthesis by the G proteins Galphao and Galphaq controls serotonin signaling in Caenorhabditis elegans. Génétique. 178, 157-169 (2008).
  36. Giordano-Santini, R., et al. An antibiotic selection marker for nematode transgenesis. Nat. Methods. 7, 721-723 (2010).
  37. Semple, J. I., Garcia-Verdugo, R., Lehner, B. Rapid selection of transgenic C. elegans using antibiotic resistance. Nat. Methods. 7, 725-727 (2010).
  38. Granato, M., Schnabel, H., Schnabel, R. pha-1, a selectable marker for gene transfer in C. elegans. Nucleic Acids Res. 22, 1762-1763 (1994).
  39. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
  40. Gong, J., et al. The C. elegans Taste Receptor Homolog LITE-1 Is a Photoreceptor. Cell. 167, 1252-1263 (2016).
  41. Liu, J., et al. C. elegans phototransduction requires a G protein-dependent cGMP pathway and a taste receptor homolog. Nat. Neurosci. 13, 715-722 (2010).
  42. Bhatla, N., Horvitz, H. R. Light and hydrogen peroxide inhibit C. elegans Feeding through gustatory receptor orthologs and pharyngeal neurons. Neuron. 85, 804-818 (2015).
  43. Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 4266-4273 (2013).
  44. Zang, K. E., Ho, E., Ringstad, N. Inhibitory peptidergic modulation of C. elegans serotonin neurons is gated by T-type calcium channels. eLife. 6, (2017).
  45. Branicky, R., Miyazaki, H., Strange, K., Schafer, W. R. The voltage-gated anion channels encoded by clh-3 regulate egg laying in C. elegans by modulating motor neuron excitability. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 34, 764-775 (2014).
  46. Hendricks, M., Ha, H., Maffey, N., Zhang, Y. Compartmentalized calcium dynamics in a C. elegans interneuron encode head movement. Nature. 487, 99-103 (2012).
  47. Nagy, S., Huang, Y. -. C., Alkema, M. J., Biron, D. Caenorhabditis elegans exhibit a coupling between the defecation motor program and directed locomotion. Sci. Rep. 5, 17174 (2015).
  48. Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. T. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8, 147-152 (2011).
  49. Stirman, J. N., et al. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8, 153-158 (2011).
  50. Kato, S., et al. Global brain dynamics embed the motor command sequence of Caenorhabditis elegans. Cell. 163, 656-669 (2015).
  51. Nguyen, J. P., et al. Whole-brain calcium imaging with cellular resolution in freely behaving Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113, 1074-1081 (2016).
  52. Toyoshima, Y., et al. Accurate Automatic Detection of Densely Distributed Cell Nuclei in 3D Space. PLOS Comput. Biol. 12, 1004970 (2016).

Tags

Ratiometric Calcium ImagingCaenorhabditis ElegansHSN NeuronBehavioral NeuroscienceGCaMP5MCherryNematode Growth MediumOP50 BacteriaVulvaInverted MicroscopeInfrared FilterVideo AnalysisStage XY Stage Control

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Ravi, B., Nassar, L. M., Kopchock III, R. J., Dhakal, P., Scheetz, M., Collins, K. M. Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans. J. Vis. Exp. (132), e56911, doi:10.3791/56911 (2018).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image