Vi presenterar ett protokoll för att undersöka överhörning mellan X-stråle-bestrålade Caco-2 och perifera mononukleära blodceller (PBMC). Protokollet börjar med Caco-2 bestrålning och uppställning av samtidig kultur med PBMC; Därefter mäts trans-epitelial resistans regelbundet över 48 h och western blot utförs i både Caco-2 och PBMC.
Protokollen som antogs i detta arbete syftar till att nysta upp hur röntgen stör tarmbarriären, funktionssätt med fokus på samspelet mellan kolorektal tumörceller och immunsystemet. Kolorektal cancer är bland den vanligaste typen av cancer, vanligtvis behandlas med kirurgi, kemoterapi och strålbehandling. Fördelarna med strålbehandling i inriktning tumören är väl kända. Ännu begränsad exponeringar av friska vävnader är dock av stor oro, särskilt när det gäller effekterna på tarmbarriären och immunsystemet. Den antagna setup tillåter för att studera samspelet mellan två cellpopulationer i ett skick som mer liknar den fysiologiska, jämfört med normala cellkulturer. För detta ändamål vi tillgripa olika tekniker och använde vi en in vitro- samtidig kultur, baserat på Caco-2-celler differentierade som en enskiktslager och PBMC, dela samma odlingssubstratet. Detta protokoll har utvecklats att fokusera på både makroskopisk effekter, dvs cellernas viabilitet och Trans-epitelial elektriska motstånd (TEER), och genom western blot, molekylära förändringar, dvs aktivering av inflammatoriska clearanceväg immunceller och den åtsittande föreningspunkt proteinuttryck i Caco-2-celler. Första utvärdering av strålningseffekter på Caco-2 cellviabilitet bedömdes via 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium metylbromid (MTT) och Trypan blå analyser, medan TEER mättes vid fasta tidsintervall genom en ohmmeter speciellt utformat för samtidig kultur system. På detta sätt kan effekterna på grund av strålning, förekomsten av perifert blod mononukleära celler (PBMC) och så småningom deras synergistisk effekt, påvisas. Genom dessa kompletterande tekniker observerat vi en hög radio-motstånd för Caco-2 inom spänna av 2-10 Gy av röntgen och en ökad Caco-2 enskiktslager permeabilitet när PBMC lades. I synnerhet befanns PBMC närvaro vara associerade med variationen i åtsittande föreningspunkt byggnadsställning proteiner uttrycket.
Den metod som antagits i detta arbete var utformade för att undersöka samspelet mellan kolorektal cancerceller och immunsystemet, att utnyttja en set-up närmare det fysiologiska villkor jämfört med normala 2-dimensionella cellkulturer.
Kolorektal cancer (CRC) anses vara den tredje vanligaste typen av cancer, med mer än en miljon fall i hela världen (Global Cancer Observatory, internationella byrån för forskning om Cancer, Världshälsoorganisationen, http://gco.iarc.fr). Hantering av CRC utförs rutinmässigt via antingen kirurgi, kemoterapi eller strålbehandling1. Jämfört med invasiva metoder såsom kirurgi eller kemoterapi, undviker strålbehandling i stor utsträckning de typiska negativa systemiska reaktioner som härrör från dessa kliniska metoder, tack vare lokaliserade leverans av stråldosen. Men kan biverkningar uppstå i de omgivande friska vävnader, utlöser inflammation med direkta skador på friska celler och skador medierade av icke öronmärkt effekter2,3,4. Fokusera på de negativa effekterna på grund av bestrålning under behandling av kolorektal cancer, måste två aspekter undersökas. Först, mekanismerna som ansvarar för intestinal ogenomtränglighet kunde ändras genom strålning leverans orsakar, i sin tur risken för biverkningar på grund av en förändrad inneslutning av bakteriepopulation och paracellular passage av molekyler och lösta ämnen. För det andra, förekomsten av gut-associerad lymfatisk vävnad (GALT) fungerar som en utpost av immunsystemet, med funktionen att kontrollera bakterietillväxt och medla den allmänna immunsvar5,6,7. För att uppfylla dessa funktioner, hålls intestinal ogenomtränglighet på grund av funktionen av Junktional komplex mellan cellernas membran. Av dessa skäl undersöktes de inducerade skadliga konsekvenserna på grund av olika doser av röntgenstrålning i Caco-2-celler ensam och i samtidig kulturer med PBMC.
Även om studier på cellkulturer är den första setline av undersökningen i biomedicinsk forskning, kan bristen på detaljerad kunskap om drivkrafterna bakom cell biologi och ömsesidiga interaktioner mellan olika celltyper bli kritisk när närmar sig studier av fysiologi av organ, system och apparater som inte kan återskapas enkelt i laboratoriet. Därför, vi beslutat att anta en gemensam kultur set-up, tillåter både studien av två cellpopulationer grupp och dissektion av aspekter som rör intercellulära och extracellulära mekanismer.
Samtidig kultur är en teknik som utnyttjas när man studerar epitelial funktioner och samspelet mellan olika celltyper. I synnerhet blir användningen av sådan teknik obligatoriskt i vårt fall, eftersom epitel består av celler kännetecknas av polaritet. När det gäller tarmbarriären, enterocyter visar en väldefinierad polarisering, med apikala och basolateral stolpar åtskilda normalt på grund av tight junction-skapa adhesionsmolekyler. Denna uppdelning behövs för vävnad fysiologi, undvika paracellular människohandel och att tillåta passage av beslutsamma molekyler endast. Denna funktion är naturligtvis omöjligt att återskapa med en normal cell odlingsskålar set-up. Antagandet av samtidig kultur set-up återger dessutom förekomsten av immunceller endast i basolateral ytan, medan den apikala ytan (motsvarande intestinala lumen) inte är direkt kontakt med andra celler.
Nyligen, Caco-2 cellinjer vunnit mer betydelse som en in vitro- modell av tarmbarriären. Även om härrör från mänskliga kolon adenokarcinom, Caco-2-celler upprätthålla differentiering och skapa en funktionell polariserade enskiktslager8, vilket gör att utredningen av cellmembranet egenskaper när den odlas i en samtidig kultur infoga.
Eftersom Caco-2 odling på ett poröst membran är en väletablerad in vitro- modell av intestinal enskiktslager, har en förbättring varit samtidig kulturen mellan Caco-2 och andra celler. Detta upplägg har antagits vanligt till åtgärd överhörning mellan olika cell typer9 och kan användas för att nysta upp Caco-2 oroade svar på yttre stimuli när i samtidig kultur, med avseende på Caco-2 odlade ensam.
Många studier har behandlat Caco-2 beteende när Co odlade med både icke-patogena bakterier och perifera mononukleära celler, att belysa särskilt överhörning med immunsystemet10blod. Pozo-Rubio o.a. 11 studerade uttrycket av flera cytokiner i en Caco-2/PBMC samtidig kultur med bifidobakterier stimulera Caco-2-celler. Deras arbete belyst väsentliga ändringen till cytokin uttrycket profiler beroende på bakteriell stimulering utförd i närvaro/frånvaro av PBMC. Deras resultat leder till slutsatsen att förekomsten av PBMC väcker intresse Caco-2 till bifidobakterier.
Olika svar av Caco-2-celler på icke-patogena och patogena bakterier har bedömts av olika forskarlag. Parlesak et al. 12 visat Caco-2-celler immunsuppressiva effekter på Escherichia coli-stimulerade PBMC. Dessutom Haller et al. 13 studerade Caco-2-celler stimuleras med båda lipopolysackarid (LPS) svar från enteropathogenic E. coli spp. eller icke-enteropathogenic bakterier i.e.E. coli spp., Lactobacillus spp., stärka den förmodan att Caco-2 cellernas svar strikt beror på närvaron av leukocyter i samtidig kultur set-up.
Genom att utföra olika kompletterande laboratorieanalyser (t.ex. western blot, trans-epitelial elektriska motstånd, MTT, etc.), förutom analysen av olika celltyper som odlas i samtidig kultur, hela metoden lovar resultat som kan anses vara mer representativ för vad som verkligen händer i vivo. Dessutom möjliggör detta upplägg separation av de olika samtidig kultur fack, så att inte bara studier av celltyper som är inblandade utan också de intercellulära signalmolekyler som släppt i det övre vs. nedre facket eller närvaro vs avsaknad av samtidig kultur.
Kolorektal cancer, med dess höga förekomsten i utvecklade länder, är en av de vanligaste orsakerna till sjuklighet och dödlighet i befolkningen. Det är vanligen hanteras av kirurgi, kemoterapi och strålbehandling1. Inom ramen för strålbehandling behandlingar, måste särskild uppmärksamhet ägnas effekterna av frisk vävnad exponering4; Dessutom, systematiska studier om sambandet mellan exponering för strålning och immunsystemet är grundläggande för att utveckla strategier för radio-immunterapi3.
Den metod som vi antog i detta arbete har skräddarsytts till utredningen av Caco-2-celler och PBMC överhörning. Vi fokuserar på effekten av röntgen exponering av tumörceller, men samma protokoll kan anpassas till studier med farmakologiska medel. Att vara närmare fysiologiska förhållanden avseende standard cellen odling, är den starka fördelen med denna metod möjligheten till en komplett dissektion av ett komplext system, få möjlighet att analysera både olika celltyper och frisläppandet av signalmolekyler i de två fack av samtidig kulturen själv. På detta sätt kan rutinmässigt tillämpad biologiska metoder hjälpa förståelsen av cellular samspel relaterade mekanismer.
Den första karakteriseringen av X-stråle-inducerad effekter på Caco-2-celler var baserat på två kompletterande mätningar, MTT kolorimetriska analysen och Trypan blått färgämne uteslutande testa dvs . De tydligen inkonsekventa resultat kunde förklaras med olika fokus för dessa två analyser. MTT bedömer mitokondriskt enzymer aktiviteten, medan den Trypan blått färgämne är baserad på en levande-cellen utslagning dye mekanism.
Utredningen av Caco-2-PBMC samspel kräver skapandet av en epitelial enskiktslager kunna leda till en fullständig separation mellan de två avdelningarna av samtidig kultur. Möjligheten att sådd Caco-2-celler i samarbete kultur infoga tillåter bestrålning av endast denna cell befolkningen. Eftersom samtidig kulturen börjar efter bestrålning, finns det inga fördomar på grund av någon oavsiktlig exponering av PBMC. Detta upplägg måste hanteras försiktigt för att undvika skada (eller kontaminering) den cellulära enskiktslager under Infoga rörelser från en 6-well platta till den andra. När noggrant utfört, är TEER mätningar en enkel och icke-invasiv metod att utreda enskiktslager permeabilitet. Denna analys är strikt relaterad till samtidig kultur set-up, och det är inte det enda valet för utredning av enskiktslager permeabilitet. Det tillåter en bra reproducerbarhet av åtgärder när det väl är kalibrerad med färska komplett medium. Gemensamma analyser fokuserar på diffusionen av kemiska färgämnen från övre ”apikala” facket till den nedre ”basolateral” en (e.g. fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC)-dextran assay)16. Men sedan PBMC är närvarande i basolateral facket i denna studie, beslutade vi att undvika införandet av kemiska reagenser i experimenten.
Bland de olika tekniker som antagits i detta arbete, är TEER mätning den enda som kräver samtidig kultur set-up17,18. Andra vanliga laboratorietekniker ger dock mer informativa resultat när de tillämpas på celler i samtidig kultur, som de tillåter utredningen av en setup närmre fysiologiska förhållanden och data har en starkare biologisk betydelse. Däremot, måste det noteras att användningen av celler som odlas på porösa underlag kan leda till vissa svårigheter i den verksamheten som behövs för att bereda proverna, såsom den cellen lysis för beredning av cellulära extrakt analyseras genom western blotting.
Systemet antogs i denna studie har potential att vara ytterligare förbättrad, t.ex. med tillämpning av ämnen kunna återskapa den extracellulära matrix-miljön. Men detta kommer också att resultera i en ökad komplexitet och en fullständig dissekering av upplägget kommer att vara svårare att uppnås.
Inställningar för samtidig cellkultur säkert representera ett kraftfullt verktyg för utvecklingen av in vitro- forskning, och för förståelsen av komplexa system. Denna teknik har potential att öka kunskapen om grundläggande mekanismer, ge nya ingångar till grundläggande forskningsstudier på molekylär signalering och med möjliga tillämpningar till moduleringen av aktiviteten i immunsystemet inom ramen för onkologisk kliniska patienthantering.
The authors have nothing to disclose.
Italienska institutet för kärnfysik (INFN) finansieras delvis detta arbete genom projektet INFN-MERIDIAN. Författarna erkänner Prof. Edoardo Milotti (fysiska institutionen, universitetet i Trieste, Italien) för INFN-MERIDIAN projektsamordning; Dr. Roberto Chignola (bioteknik institutionen, universitetet i Verona, Italien) för att tillhandahålla de Caco-2-cellerna, ohmmeter, och hans värdefull hjälp och utbildning. Vi erkänner också Agnese Solari för tekniskt bistånd.
ThinCert 6 Well Cell Culture Inserts for Multiwell Plates |
Greiner Bio-one | 657610 | Equipment |
Cell Culture Multiwell Plate, 6 Well | Greiner Bio-one | 657160 | Plastic |
Cell Culture Multiwell Plate, 24 Well | Greiner Bio-one | 662160 | Plastic |
RPMI 1640 without L-Glutamine | Lonza | 12-167F | Reagents |
Foetal Bovine Serum | Lonza | DE14-801 | Reagents |
L-Glutamine 200 mM | Lonza | 17-605C | Reagents |
Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | 17-602E | Reagents |
CO2 Incubator | Heal Force | HF240 | Equipment |
Ficoll Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | Reagents |
Tube, 50 mL, PP, Conical Bottom | Greiner Bio-one | 227261 | Plastic |
Tube, 15 mL, PP, Conical Bottom | Greiner Bio-one | 188261 | Plastic |
Centrifuge | ThermoScientific | CL31R | Equipment |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P3813 | Reagents |
Cell Culture Flask, 25 cm2, PS | Greiner Bio-one | 690175 | Plastic |
Clinac 2100 Linear Accelerator | Varian | CLINAC 2100C/D | Equipment |
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M5655 | Reagents |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Reagents |
Multiwell Plate Reader | GDV | DV990BV6 | Equipment |
Trypan Blue Solution 0,4 % | Amresco | K940 | Reagents |
Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrich | T4049 | Reagents |
1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030125150 | Reagents |
Millicell-ERS voltmeter/ohmeter | Millipore | MERS 00001 | Equipment |
Cell Lysis Buffer (10x) | Cell Signalling Technology | #9803 | Reagents |
Bürker Hemocytometer | Sigma-Aldrich | BR719520 | Equipment |
BCA Protein Quantification Kit | Abcam | ab102536 | Reagents |
2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | #1610737 | Reagents |
2-Mercaptoethanol | BioRad | #1610710 | Reagents |
Accublock Digital Dry Bath | Labnet International Inc. | D1100 | Equipment |
4–20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels, 10 well, 30 µL | BioRad | #4568093 | Reagents |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel | BioRad | #1658004 | Equipment |
PowerPac HC High-Current Power Supply | BioRad | #1645052 | Equipment |
Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards | BioRad | #1610385 | Reagents |
10x Tris/Glycine/SDS Running Buffer | BioRad | #1610732 | Reagents |
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs | BioRad | #1704156 | Reagents |
Trans-Blot Turbo Transfer System | BioRad | #1704150 | Equipment |
Blotting-Grade Blocker | BioRad | #1706404 | Reagents |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 | Reagents |
Claudin-1 (D5H1D) XP Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | #13255 | Reagents |
Bovine Serum Albumine | Sigma-Aldrich | A7906 | Reagents |
ZO-1 (D7D12) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | #8193 | Reagents |
ZO-2 Antibody | Cell Signalling Technology | #2847 | Reagents |
Afadin (D1Y3Z) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | #13531 | Reagents |
Anti-Occludin Antibody | Millipore | ABT146 | Reagents |
Anti-NF-kB p65 antibody [E379] | Abcam | ab32536 | Reagents |
Anti-XIAP antibody | Abcam | ab21278 | Reagents |
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) | GE Healthcare Life Sciences | NA931V | Reagents |
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) | GE Healthcare Life Sciences | NA934V | Reagents |
Clarity Western ECL Substrate, 200 mL | BioRad | #1705060 | Reagents |
Carestream Kodak autoradiography GBX developer/replenisher | Sigma-Aldrich | P7042 | Reagents |
Carestream Kodak autoradiography GBX fixer/replenisher | Sigma-Aldrich | P7167 | Reagents |
Carestream Kodak BioMax light film | Sigma-Aldrich | Z370401 | Reagents |
Gel Doc EZ System | BioRad | #1708270 | Equipment |