באמצעות תלת-צבעי קשת/קשתית מולקולה בודדת ללמוד הקורלציה של אינטראקציות חלבון

חלבונים רבים ממלאים תפקידם במתחמי דינמי עם מולקולות אחרות, מתווכת על-ידי שינויים הסתגלותי ואגודות ארעי על מגוון רחב של צירי זמן-^1,–^2,–³. מצמידים חיצוני כמקור אנרגיה (למשל, ATP) אינטראקציות דינמי אלה יכולים להוביל כיוון במחזור פונקציונלי ולתחזק בסופו של דבר ללא שיווי משקל היציב-המדינה בתא, תנאי מוקדם לכל החיים.

כדי להבין באופן מלא את מכונות מולקולריות אלה, תיאור סטטי מודרכת על ידי מחקרים מבניים אינה מספיקה. בנוסף, זה חיוני לא ידע קינטי מהמודל המשמש כבסיס וכדי לקבוע את קבועי קצב קינטי. קיימות מספר שיטות לאפשר לחוקרים ללמוד את הדינמיקה של האינטראקציות בינארית בין שתי מולקולות של עניין, למשל, פני השטח פלזמון תהודה, שיטות הרפיה עם הבדיקה ספקטרוסקופיות (למשל, קפיצה או זרימה עצר טכניקות), ותהודה מגנטית גרעינית. אולם, ישימות שלהם הוא ברוב המקרים מוגבל שתי המדינות מערכות פשוטות (למשל, אחד מאוגד, מדינה לא מאוגד) עקב בממוצע הטמון בניסויים בצובר. במקרים שבהם מעורבים יותר מדינות או intermediates, הן מפיקות רק תערובת מורכבת של הקבועים קצב. מולקולה בודדת שיטות כגון פינצטה אופטית או מגנטי או smFRET שני צבעים, קרי, תורם אחד אחד מקבל fluorophore, עם דגימת משטח. מרותק למיטה יכול לשחזר את קבועי קצב לכל נצפו שינויים הסתגלותי. אולם, כשמדובר אינטראקציות המשפיעים על אתר קישור אחד או יותר, שיטות אלה נשארים מוגבל, המידע לאינטראקציות מתאם אפשרי של השניים (או יותר) רק יהיה נגיש דרך עקיפה מסקנות ערכה של ניסויים.

צבע רב smFRET^4,5,6,7,8,9 מציע הזדמנות ללמוד את האינטראקציה בין רכיבים אלה באופן ישיר, בזמן אמת, תחת תנאים ליד-פיזיולוגיים¹⁰. זה מתיר אחד לחקור לדוגמה, הכריכה תלויי-קונפורמציה של ליגנד או חלבון אחר^8,9,11. הגישה הכללית המובאת כאן היא לסמן את protein(s) של עניין-עמדות מסוימות, כדי לצרף חלבון אחד על פני השטח של התא מדידה, וכדי לעקוב אחר עוצמת קרינה פלואורסצנטית לאורך זמן על TIRFM פריזמה-סוג (עבור פרטים ראה ^{9 , 12}). הקרבה המרחבי של צבעים שונים ואז יכול להיקבע מתוך העברת האנרגיה ביניהם. תיוג אסטרטגיות עשויים להשתנות מחלבון לחלבון (נבדקה ¹³), קווים מנחים כדי להימנע חפצים במדידות smFRET קיימים¹⁴.

מאז צבע התורם יכול להעביר אנרגיה שונה מקבל צבע בניסוי צבע רב smFRET, המיקום היחסי של כל צבעי אינו נגיש של עירור של צבע אחד לבד^15,16. אבל בשילוב עם מתחלפים עירור לייזר (אלכס¹⁷, ו שנסקרה ב ¹⁸) שיטה זו מספקת את כל המידע-עתיים-פחות משנייה והרזולוציה תת ננומטר.

המנהל, נתוני מבנה יכולה להיות מושגת על ידי שימוש של המרחקים בין צבע ברזולוציה גבוהה מחושב משילוב של כל עוצמות קרינה פלואורסצנטית בניסוי צבע רב smFRET עם אלכס. עם זאת, כאן אנו מתמקדים זיהוי מצב, הפרדה, כמו גם הפקת מודלים קינטי, שבו צבע רב smFRET היא הכרחית. כאשר “רק” מבנה נחישות על ידי טריאנגולציה היא הרצויה, ערכת ניסויים פשוטים smFRET שני צבעים עם יחס אות לרעש גבוה יכול להיות בביצוע^12,19.

אנו משתמשים על ידי קרינה פלואורסצנטית חלקית () כמדד להעברת אנרגיה בין שני fluorophores⁷. PF מחושבת על פי עוצמת קרינה פלואורסצנטית מקביל היעילות סריג של ניסוי שני צבעים:

איפה, הוא עוצמת ב פליטה ערוץ em לאחר עירור עם צבע לשעברו- c הוא מקבל עם אורך הגל הארוך ביותר. זיהוי ערוצי מייצגים באותה התנוחה לדוגמה קאמרית, אבל הרשומה טווחי האור פלורסצנטיות ספקטרלי שונים. אותו מזהה עירור, פליטה נמצאים בשימוש פרוטוקול זה (קרי, “כחול”, “ירוק” או “אדום”).

בגלל חסרונות ניסיוני עוצמות קרינה פלואורסצנטית נמדד תלויים לא רק על העברת אנרגיה, אלא גם על מאפייני fluorophore וההתקנה. על מנת להשיג את יעילות העברת אנרגיה אמיתית בין שתי fluorophores, עוצמות נמדד צריך לתקן. ההליך הבא מבוסס על התייחסות⁹. גורמים תיקון דליפה נראית לעין (lk, קרי, הגילוי של פוטונים מ fluorophore בערוץ המיועד צבע אחר), גאמה נראית לעין (ag, קרי, התשואה קוונטית זריחה של לצבוע את זיהוי יעילות של הערוץ) מתקבלים מן עקבות מולקולה בודדת המציגים מקבל של הלבנת אירוע.

דליפת לצבוע התורם לתוך בכל ערוץ אפשרי מקבל מחושבת על פי כל נקודות נתונים עקבות קרינה פלואורסצנטית מוקלט שבו מקבל לצבוע מולבן אך התורם הוא עדיין פלורסנט ():

החציון של ההיסטוגרמה זליגת משמש כגורם זליגת נראית לעין. לאחר תיקון עבור דליפה, הגורם גמא לכאורה נקבע מתוך אותה קבוצה של עקבות. הוא מחושב על ידי חלוקת השינוי של קרינה פלואורסצנטית בערוץ מקבל על ידי השינוי של קרינה פלואורסצנטית בערוץ התורם על הלבנה של לצבוע מקבל:

כאשר c הוא שוב בערוץ זיהוי עבור מקבל עם אורך הגל הארוך ביותר. החציון של ההתפלגות וכתוצאה מכך משמש פקטור התיקון נראית לעין.

עוצמות המתוקן בכל אחד מהערוצים מתקבלים על ידי:

PF לאחר מכן מחושב על פי:

ניתן להפריד בין אוכלוסיות שונות במרחב רב ממדית שמקיפות את s PF. המיקום ואת הרוחב של כל מדינה נקבע על ידי התאמת הנתונים עם פונקציות גאוסיאנית רב-מימדי. אופטימיזציה עוקבות של אחד הממ גלובלית המבוססת על כל עקבות PF מספק תיאור כמותי של קינטיקה התצפיות. אפילו שינויים קטנים של התעריפים הן לזיהוי.

HMMs מספקים דרך של אומדן משוער מודל המדינה מאוסף של עקבות הזמן רועש. המערכת נחשבת באחד ערכה של בדידה, הברית מוסתרים בכל זמן נתון, התצפית בפועל (קרי, הפליטה) היא פונקציה הסתברותית של המדינה מוסתרים²⁰. במקרה של נתונים smFRET TIRFM, פליטת הסתברויות b_אני לכל המדינה אני שניתן למדל באמצעות פונקציות צפיפות ההסתברות גאוסיאנית רציפה. בנקודות זמן בדידים מפוזרים באופן קבוע, מעברים מאחד למדינה אחרת יכולה להתרחש לפי ההסתברות מעבר הזמן-שמורה, רק תלויה במצב הנוכחי. המטריקס המעבר A מכיל אלה הסתברות המעבר _ij בין כל המדינות מוסתרים. התפלגות המצב ההתחלתי של נותן ההסתברויות ספציפיים- לנקודה בפעם הראשונה של עקבות הזמן. שימוש בגישה מרבי-הסבירות, פרמטרים אלה ניתן למטב בצורה הטובה ביותר לתאר את הנתונים עם קדימה-אחורה, באום-ולש אלגוריתמים^20,21. זה מניב את estimators נראות מקסימלית (MLE). לבסוף, שניתן להסיק על רצף מצב סביר הפיק את המסלול של תצפיות עם אלגוריתם ויטרבי. בניגוד אחרים ניתוחים הממ של smFRET נתונים^24,25,26 אנחנו לא משתמשים את הממ כמו גרידא “החלקה” של נתונים אבל תמצית המודל המדינה קינטי של ערכת הנתונים ללא הצורך עבור התאמת זמן להתעכב היסטוגרמות²⁷. ניתוח הממ מתבצעת באמצעות קבצי script ללא צורך במיקור חוץ באמצעות איגור Pro. הטמעת הקוד מבוסס על התייחסות²¹. אנו מספקים ערכת תוכנה ונתונים למופת בדף שלנו לעקוב סעיפים 5 ו- 6 של פרוטוקול זה, (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret). תוכנה מלא הינו זמין על פי בקשה.

נקודות הנתונים עם PF זמן <-1 או PF > 2 בערוץ כל זיהוי מוקצים ההסתברות פליטה מינימלית על כל המדינות (10^-200). פעולה זו מונעת מעברים מלאכותי בנקודות אלו נתונים.

הפרמטרים עבור ההסתברויות פליטה מתקבלים מן ההתאמה של ההיסטוגרמה PF 3D עם פונקציות לפי עקומת גאוס, כפי שמתואר בשלב 5.7. פרמטרים אלה נשמרים קבועים במהלך אופטימיזציה של הממ.

הגישה שהוצגו, הווקטור הפצה המצב ההתחלתי של המטריקס המעבר משמשים באופן גלובלי לתאר את ההרכב כולו עקבות. והם מתעדכנים בהתבסס על כל N מולקולות של ערכת הנתונים על פי הפניה²⁷.

התחל פרמטרים עבור התפלגות המצב ההתחלתי נקבעים מתוך תחזיות דו-מימדית של ההיסטוגרמה PF (שלב 5.3) ולא ההסתברויות המעבר מוגדרות כ 0.05 למעט ההסתברויות כדי להישאר באותו המצב, אשר נבחרו כך כי ההסתברות לעזוב את מצב מסוים מנורמל לאחדות.

שיטה פרופיל הסבירות משמש כדי לתת מרווחי ביטחון (CIs) עבור כל המעבר המחירים^21,22, אשר לשמש הערכות משמעותי עבור חוסר הבהירות. לחישוב גבולות של המודיע על שיעור מסוים, ההסתברות המעבר של ריבית קבוע בערך השונה MLE. זה מניב את λ דגם המבחן ‘. מבחן הסבירות יחס (LR) הסבירות בהתחשב ערכת הנתונים 0 מתבצע על פי:

ביטחון 95% המאוגד עבור הפרמטר הוא הגיע כאשר LR חורג 3.841, quantile 95% של x²-התפלגות עם דרגת חופש אחת^22,23.

כוחה של השיטה הוא הפגין באמצעות של Hsp90. החלבון בשפע זה נמצא ב חיידקים וב פרוקריוטים והוא חלק תגובת לחץ הסלולר²⁸. זה מטרה סמים מבטיח טיפול בסרטן²⁹. Hsp90 הוא homodimer עם כיס כריכה נוקלאוטיד בתחום N-מסוף של כל יחידה משנית³⁰. זה יכול לעבור במעברים בין לפחות שני הייצורים החיים באופן גלובלי מובהק, אחד סגור,^31,19,פתוח, בצורת V קונפורמציה N-מסוף אחד³². הטבע dimeric ישירות מעלה את השאלה של יחסי הגומלין בין האתרים מחייב נוקלאוטיד שני ב- Hsp90.

בחלק זה, אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד עבור רכישת נתונים וניתוח של ניסוי smFRET תלת-צבעי על שמרים Hsp90, נוקלאוטיד. הכריכה תלויי-קונפורמציה של המגבר-PNP שכותרתו fluorescently (AMP-PNP *, אנלוגים הלא-hydrolyzable ATP) ניתוח. היישום של ההליך המתואר היתרים המחקר של האיגוד נוקלאוטיד ו באותו הזמן את השינויים הסתגלותי של Hsp90, ובכך חושף את cooperativity בין איגוד נוקלאוטיד שני הכיסים של Hsp90.