Zika-Virus spezifische diagnostische Epitop Entdeckung
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Technik, um Zika Virus spezifische diagnostische Peptide mit einer High-Density-Peptid-Microarray entdecken. Dieses Protokoll kann für andere neu auftretende Infektionskrankheiten readly angepasst werden.
Abstract
High-Density-Peptid Microarrays erlauben Screening von mehr als sechs tausend Peptide auf einer einzigen Standard-Mikroskopie-Folie. Diese Methode kann für Arzneimittelforschung, therapeutischen Target-Identifizierung und Entwicklung von Diagnostika. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um spezifische Zika Virus (ZIKV) diagnostische Peptide mit einer High-Density-Peptid-Microarray entdecken. Eine menschliche Serumprobe für ZIKV Infektion mit einer High-Density-Peptid Microarray enthält das gesamte ZIKV Protein übersetzt 3.423 einzigartige 15 linear (aa) Aminosäureresten mit einer 14-aa Rückstände Überlappung inkubiert wurde validiert in zweifacher Ausfertigung gedruckt. Färbung mit verschiedenen Sekundärantikörper innerhalb desselben Arrays, erkannt wir Peptide, die Bindung an Immunglobulin M (IgM) und Immunglobulin G (IgG) Antikörper im Serum vorhanden. Diese Peptide wurden für weitere Validierung Experimente ausgewählt. In diesem Protokoll beschreiben wir die Strategie zu entwerfen, zu verarbeiten und ein High-Density-Peptid-Microarray zu analysieren.
Introduction
Zika Virus (ZIKV) Diagnose anhand der klinischen Symptome ist schwierig, weil es Vektoren, geographische Verbreitung und Symptome mit Dengue-Fieber und Chikungunya-Virus-Infektion1teilt. Angesichts des Risikos für unerwünschte Schwangerschaft Ergebnisse bei Frauen während der Schwangerschaft mit ZIKV infiziert, ist es wichtig, zwischen den 3 Viren zu unterscheiden. Obwohl die aktuellen molekularer diagnostischer Tests spezifisch sind, sind sie nur während der relativ kurzen Zeit der akuten Infektion2,3nützlich im Blut oder Speichel. Serologische Tests sind unerlässlich für die Diagnose außerhalb dieser Phase der Infektion4.
Die Entwicklung eines spezifischen serologischen ZIKV-Assays ist anspruchsvoll, aus zwei Gründen: Erstens der Zika-Antigene, die auf das menschliche Immunsystem reagiert sind derzeit nicht bekannt; und zweitens konservierten Flaviviren Aminosäuresequenzen veranlassen Antikörper Kreuzreaktivität. Unser Ziel war es, entdecken einzigartige ZIKV spezifische Peptide in der Diagnostik verwendet werden. Verschiedene Ansätze wurden entwickelt, um einen Bildschirm Peptid Bibliotheken für ganze Proteine einschließlich Phagen, bakterielle, und Hefe Oberfläche display5,6,7,8,9, 10. Unsere Strategie war es, ein High-Density-Peptid-Microarray verwenden, die schnelle und kostengünstige Hochdurchsatz-serologische Untersuchungen11,12 erlaubt und anschließend die identifizierten Peptide können zur Verbesserung der serologischen Assays für die Erkennung von ZIKV Infektion.
Dieses Protokoll ermöglicht die Entdeckung von Zika Virus spezifische diagnostische Peptide mit einer High-Density-Peptid Microarray (Abbildung 1). Die High-Density-Peptid-Microarray wurde mit der Peptid-Laserdrucktechnologie hergestellt. Die gesamte ZIKV Proteinsequenz bestehend aus 3.423 Aminosäurereste basierend auf dem französischen polynesischen Stamm (GenBank: KJ776791.2), wurde gedruckt auf einer standard-Glas-Folie in Blöcken von 15 lineare Rückstände mit einer Überlappung von 14 Aminosäurereste in doppelter Ausführung für eine insgesamt 6.846 Peptid Flecken. Neben der gesamten Zika Protein Sequenz Peptide, nutzt die Microarray Influenza Hämagglutinin (HA) Peptide für interne Kontrollen.
Ein Zika bestätigt positive Serumprobe gewonnenen Wadsworth Center (Albany, NY), verwendet wurde, um spezifische Immunglobulin M (IgM) und Immunglobulin G (IgG) reaktive Peptide zu identifizieren. Nach Inkubation mit der Probe über Nacht, war die Microarray gebeizt mit einem sekundären Fluorochrom konjugierten Antikörper (Anti-Human IgM oder Anti-Human-IgG) und auf einem Microarray Scanner analysiert. Quantifizierung der spot Intensitäten und Peptid-Annotation erfolgte mit einer speziellen Software zur Verfügung gestellt von der gleichen Firma, die die Microarray hergestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir entwarfen ein Protokoll mit Hilfe einer High-Density-Peptid Microarray enthält die gesamte Zika Virus Proteinsequenz (Französisch Polynesischen Stamm). Die Microarray wurde von Druck 3.423 anderen überlappenden lineare Peptide hergestellt. Jedes Peptid war 15 Aminosäuren und durch nur einen Rückstand von seinem nächsten Nachbarn in der Reihenfolge (d.h. 14 Rückstände Überlappung) variiert. Obwohl kürzere Überschneidungen gedruckt werden können, ist Epitop Mapping präziser mit längeren Überschn…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Von NIDCRR44 DE024456 wird es durch einen SBIR (Small Business Innovation Research) administrative Ergänzung Grant aktuelle unterstützt. NIDCR HIV-Stipendium, das aus NIDCR Zuschuss U01 DE017855 für die Entwicklung einer bestätigenden Point-of-Care-Diagnostik für HIV entwickelt. Wir erkennen dankbar Silke Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) für ihre technische Hilfe und freundliche Unterstützung. Wir danken auch NYU Langone Medical Center für die LI-COR Odyssey Imaging System.
Materials
| PEPperCHIP Custom Peptide Microarray | PEPperPRINT | PPC.001.001 | Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence |
| PEPperCHIP incubation tray 3/1 | PEPperPRINT | PPC.004.001 | |
| PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling) | PEPperPRINT | PPC.037.002 | |
| PepSLide Analyzer | PEPperPRINT | PSA.004.001 | 14-days free License for Windows |
| Rockland Blocking buffer | Rockland | MB-070 | |
| anti-human IgM (mu chain) DyLight 800 | Rockland | 609-145-007 | |
| anti-human IgG Fc DyLight 680 | Thermo Scientific | SA5-10138 | |
| LI-COR Odyssey Imaging System | LI-COR | ||
| Orbital shaker device | IKA | MTS 2/4 digital microtiter shaker | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Deltagraph | Redrocks |
References
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